戴功建,金黑鷹

(南京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院全國肛腸醫(yī)療中心,江蘇南京,210001)

結(jié)直腸癌是消化系統(tǒng)最常見的腫瘤,化療是其主要治療手段之一,新型抗腫瘤藥物的開發(fā)利用是目前研究的主要課題。冬凌草甲素是一種從唇形香茶菜屬植物中提取的一種貝殼杉烯二萜類天然有機化合物,近年來的研究表明冬凌草甲素對體內(nèi)的各種腫瘤都有一定的抑制作用,臨床上報導(dǎo)對食管癌、胃癌的應(yīng)用取得了一定的療效[1-2],但在結(jié)直腸癌的研究鮮有報導(dǎo)。從分子生物學(xué)上,結(jié)直腸癌可以分為微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(MSI)和微衛(wèi)星穩(wěn)定性2種,MSI結(jié)直腸癌占結(jié)直腸癌的20%～30%,是由于錯配修復(fù)基因表達缺失,DNA復(fù)制錯誤增加,微衛(wèi)星不穩(wěn)定,導(dǎo)致結(jié)直腸癌發(fā)生[3]。許多研究認為冬凌草甲素明顯激活了細胞增殖、細胞周期的各個階段和抗凋亡作用[4-5]。本研究繼續(xù)探索冬凌草甲素對錯配修復(fù)基因表達缺失的結(jié)直腸癌的作用,旨在為其抗腫瘤作用提供實驗依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 實驗材料

細胞株:Lovo細胞(hMSH2缺失結(jié)腸癌細胞株)購自中國科學(xué)院上海細胞生物研究所。

冬凌草甲素制備:冬凌草甲素購自中國藥品生物制品鑒定所標準品,以蒸餾水配置成50 mg/mL的溶液,滅菌后備用。

實驗動物:BALB/C nu/nu裸鼠,SPF級,購自北京科麗華實驗動物中心,體重24～28 g,分籠飼養(yǎng)于獨立送風(fēng)籠具,室溫控制在24℃～25℃,相對濕度50%～60%。

1.2 實驗方法

細胞株及細胞培養(yǎng):人結(jié)腸腺癌細胞株(Lovo、SW480)購自中國科學(xué)院上海細胞生物研究所。Lovo、SW480細胞以 RPMI-1640培養(yǎng)基,10%小牛血清,在37℃,5%CO2培養(yǎng),0.25%胰酶-EDTA消化,PBS洗2次,調(diào)整細胞濃度制成1×106的細胞懸液。

裸鼠皮下接種模型的建立:裸鼠頸部右側(cè)皮膚消毒,用一次性1 mL注射器將Lovo細胞懸液注入皮下0.2 mL/只。注射完畢后,對注射部位進行觀察,約4周成瘤,對成瘤小鼠進行觀察,待其自然死亡后解剖觀察腫瘤特點,腫瘤在肺、肝、腸系膜處轉(zhuǎn)移情況。

結(jié)腸造口結(jié)腸癌原位移植模型的建立 氯胺酮(0.17 mg/mL)裸鼠腹腔注射麻醉,左腹部碘酊消毒,將皮膚及腹膜剪一小口,將裸鼠盲腸提出腹壁約0.5 cm,以5-0縫線將盲腸與周圍皮膚縫合固定,術(shù)后注意補充葡萄糖生理鹽水,加強營養(yǎng),術(shù)后2～3 d造口部位會結(jié)痂,約1周結(jié)痂脫落,露出腸道。術(shù)后4周取裸鼠皮下接種腫瘤,切取1 mm3的腫塊2塊,種植于造口處盲腸,待腫瘤生長至5 mm時開始進行冬凌草甲素處理。

分組及用藥:選取已結(jié)腸造口結(jié)腸癌原位移植模型40只,設(shè)空白對照組10只、5.0 mg/kg、7.5 mg/kg和10 mg/kg冬凌草甲素處理組各10只。冬凌草甲素組予以相應(yīng)劑量冬凌草甲素腹腔注射,1次/d,對照組予以等體積生理鹽水腹腔注射,連續(xù)5 d,觀察腫瘤增長情況。

腫瘤體積和抑制率計算:分別于用藥前、用藥后 1、2、3、4和 5周末測量在體腫瘤大小,計算腫瘤體積和腫瘤抑制率。Genescan方法檢測微衛(wèi)星不穩(wěn)定情況和TGFβ1、TGFβ2和 IGF片段的大小變化。腫瘤體積估計公式為:(腫瘤長軸×腫瘤短軸2)/2;腫瘤抑制率估算公式:(用藥后腫瘤體積-用藥開始腫瘤體積)/用藥開始腫瘤體積。

腫瘤組織中MSI以及轉(zhuǎn)化生長因子β1、轉(zhuǎn)化生長因子β2和胰島素樣生長因子片段的大小變化檢測:分別于用藥前和用藥后 3、7、14、21、28d于腫瘤處取材,采用Genescan法檢測微衛(wèi)星不穩(wěn)定情況,并檢測轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)、TGF-β2和胰島素生長因子(IGF)片段的大小變化,方法、使用試劑及引物序列參考文獻[6-7]。抽取基因組DNA,以聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法擴增上述片段,反應(yīng)體系20 μ L,反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性15 min,94℃變性1 min,56℃退火1 min,72℃延伸1 min,72℃充分延伸25 min。共30個循環(huán) 。取 1 μ L PCR 反應(yīng)產(chǎn)物與 0.4 μ L LIZ(內(nèi)標)和9 μ L甲酰胺混合,然后在ABI3100-Avant測序儀上毛細管電泳法電泳 45 min。DatacoLLection軟件自動進行數(shù)據(jù)收集和處理,并生成原始的樣品數(shù)據(jù)文件。

2 結(jié) 果

2.1 使用冬凌草甲素處理結(jié)腸造口的結(jié)腸癌原位移植模型的結(jié)果

5.0 mg/kg、7.5 mg/kg和 10 mg/kg 3個治療組在注射冬凌草甲素后,1周開始出現(xiàn)腫瘤的縮小,2～3周腫瘤縮小最多,在3周以后腫瘤開始增長;而對照組腫瘤一直處理增長狀況。在2、3、4、5周,治療組和對照組腫瘤抑制率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);方差分析進行3個治療組之間的腫瘤抑制率的比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.2 結(jié)腸造口的結(jié)腸癌原位移植模型的腫瘤微衛(wèi)星不穩(wěn)定和TGFβ1、TGFβ2和 IGF片段大小變化

在空白對照組,能擴增到的4個微衛(wèi)星標志和TGFβ1、TGFβ2和 IGF 均出現(xiàn)延長和縮短。在空白對照中,出現(xiàn)了MSI和一些簡單重復(fù)序列的延長和縮短,提示Lovo在增殖過程表現(xiàn)出明顯的含簡單重復(fù)序列基因的突變,符合Lovo細胞的增殖特點,在使用冬凌草甲素治療后,微衛(wèi)星標志和攜帶簡單重復(fù)序列的基因的變異仍呈現(xiàn)不穩(wěn)定趨勢,較治療前無明顯變化。

3 討 論

冬凌草甲素具有抗腫瘤、抗突變的重要作用[8-9],目前研究認為其抗腫瘤的作用主要是通過誘導(dǎo)細胞凋亡而發(fā)揮作用[10-11],在前期的研究中,發(fā)現(xiàn)冬凌草甲素對微衛(wèi)星不穩(wěn)定的結(jié)腸癌細胞具有特異性的抑制作用,在一個比較小的劑量時即能達到比較高的腫瘤抑制率,其在體對于腫瘤治療的效果如何目前尚無報導(dǎo)。許多研究表明,冬凌草甲素具有抗腫瘤和抗基因突變的作用[12-13]。本研究發(fā)現(xiàn)冬凌草甲素對LOVO細胞有抑制作用,且抑制率可以達到 80%以上,對LOVO細胞的作用隨著作用時間延長而增加、隨作用劑量的增加而增加,具有時間和劑量依賴特點。當(dāng)其濃度超過20 μ g/mL后其抑制率不再隨濃度的上升而提高,且經(jīng)過處理后LOVO細胞仍呈微衛(wèi)星不穩(wěn)定狀態(tài),故冬凌草甲素不能抑制錯配修復(fù)基因缺失的結(jié)直腸癌的基因突變的發(fā)生,但是,冬凌草甲素是怎樣抑制錯配修復(fù)基因缺失的結(jié)直腸癌細胞的生長,其具體機制需做進一步的研究。

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