王紹輝，崔志峰

(浙江工業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江杭州310032)

α-淀粉酶發(fā)酵生產(chǎn)影響因素的研究進(jìn)展

王紹輝，崔志峰*

(浙江工業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江杭州310032)

α-淀粉酶作為一種重要的工業(yè)酶制劑，在工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用十分廣泛。對(duì)近年來報(bào)道的有關(guān)溫度、pH、碳氮源、金屬離子、微量元素、溶氧、發(fā)酵工藝等影響α-淀粉酶發(fā)酵生產(chǎn)的各種因素進(jìn)行了綜述，旨在為指導(dǎo)α-淀粉酶的工業(yè)生產(chǎn)和進(jìn)一步提高生產(chǎn)效率提供參考。

α-淀粉酶，碳氮源，金屬離子，微量元素，發(fā)酵工藝

1 培養(yǎng)基成分對(duì)發(fā)酵生產(chǎn)的影響

1.1 碳氮源對(duì)發(fā)酵生產(chǎn)的影響

在α-淀粉酶發(fā)酵生產(chǎn)中常用的碳源為可溶性淀粉或生淀粉，常用的氮源有酵母提取物、大豆粉、肉汁提取物、蛋白胨等。但是，從工業(yè)能耗和生產(chǎn)成本考慮，越來越多的生產(chǎn)廠家開始用一些低成本又能提供良好碳氮源的農(nóng)業(yè)廢料如麩皮、油餅來替代成本較高的可溶性淀粉、酵母膏和蛋白胨等精細(xì)碳氮源。盡管麩皮等殘料在顆粒大小、碳氮比例上參差不齊，同時(shí)這類殘料含有一些未知的雜質(zhì)，然而這些替代品不但能提供豐富的營養(yǎng)，而且成本十分低廉，經(jīng)過研究和優(yōu)化可以成為良好的碳氮源。

利用低成本的農(nóng)業(yè)原料將是以后大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)的趨勢(shì)。Saban［5］等研究 Bacillus amyloliquefaciens NRRL-645利用蓖麻油餅發(fā)酵生產(chǎn)α-淀粉酶時(shí)，用響應(yīng)面法對(duì)固體發(fā)酵過程中蓖麻油餅、蛋白胨、酵母提取物和(NH4)2SO4進(jìn)行了優(yōu)化，當(dāng)蓖麻油餅、蛋白胨、酵母提取物、(NH4)2SO4的含量分別為22.62、5.20、1.62、6.81g/L時(shí)，α-淀粉酶產(chǎn)量可達(dá)到最高為4895U;而在實(shí)際培養(yǎng)中產(chǎn)量達(dá)到了4827U，與優(yōu)化前相比提高了8%。

Rajagopalan［6］等以農(nóng)業(yè)廢料作為碳氮源，利用一株枯草芽孢桿菌KCC103進(jìn)行α-淀粉酶的深層液體發(fā)酵生產(chǎn)。實(shí)驗(yàn)首先對(duì)一系列可以作為碳源的麥麩、甘蔗渣、米糠和麥桿等農(nóng)業(yè)廢料作了調(diào)查，發(fā)現(xiàn)利用麥麩生產(chǎn)α-淀粉酶產(chǎn)量最高，這與麥麩含有大量的碳水化合物和蛋白質(zhì)有關(guān)。實(shí)驗(yàn)還對(duì)適合作為氮源的太陽花油餅、蓖麻油餅、棉籽油餅、芝麻油餅和花生油餅進(jìn)行了分析，其中太陽花油餅最適合枯草芽孢桿菌KCC103進(jìn)行α-淀粉酶生產(chǎn)。實(shí)驗(yàn)將麥麩和太陽花油餅以1∶1進(jìn)行混合發(fā)酵得到了較高的α-淀粉酶產(chǎn)量(90U/mL)。根據(jù)響應(yīng)面法對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化后產(chǎn)量進(jìn)一步提高，當(dāng)將麥麩和太陽花油餅以1.27%和1.42%進(jìn)行混合發(fā)酵時(shí)，產(chǎn)量比原來提高了14倍，達(dá)到1258U/mL。

在固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)α-淀粉酶時(shí)，麩皮作為廉價(jià)的農(nóng)業(yè)加工產(chǎn)品的廢棄物是十分常用的替代碳源。劉仲敏［7］等在研究米曲霉ZLF13固態(tài)發(fā)酵時(shí)發(fā)現(xiàn)麩皮中淀粉的含量會(huì)影響到最終α-淀粉酶的產(chǎn)量。在培養(yǎng)基滅菌后，淀粉含量少的麩皮不易粘成團(tuán)，有利于通氣，但是碳氮比較低;而淀粉含量過高的麩皮滅菌后易粘成團(tuán)，影響通氣性，而且粘團(tuán)內(nèi)部的淀粉也不利于菌絲的利用吸收。通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，出粉率在60%左右的麩皮最適合用于米曲霉ZLF13生產(chǎn)α-淀粉酶，在這種生產(chǎn)條件下得到的α-淀粉酶的酶活最高，在中試中平均酶活可達(dá)到1283U/g。

1.2 金屬離子和其他無機(jī)離子對(duì)發(fā)酵生產(chǎn)的影響

α-淀粉酶是一種金屬酶，在發(fā)酵過程中適當(dāng)?shù)丶尤胍恍┙饘匐x子對(duì)于α-淀粉酶的產(chǎn)量有一定的促進(jìn)作用。Gupta等曾對(duì)一些金屬離子的影響作過綜述，常見的金屬離子如K+、Fe2+、Mo2+、Cl-等對(duì)于α-淀粉酶的產(chǎn)量基本沒有影響;Mg2+則對(duì)產(chǎn)量起著關(guān)鍵的作用，在沒有添加Mg2+的情況下產(chǎn)酶量會(huì)下降50%;Mn2+對(duì)于產(chǎn)量也會(huì)有一定的促進(jìn)作用;而Co2+可以使菌體量大大增加但是會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)量有一定的下降［8］。Dhanya［9］等用 Box-Behnken理論對(duì)Bacillus amyloliquefaciens利用麥麩和花生油餅深層液體發(fā)酵生產(chǎn)α-淀粉酶進(jìn)行優(yōu)化時(shí)發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)時(shí)間和CaCl2濃度對(duì)發(fā)酵結(jié)果起決定作用。當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間和CaCl2濃度分別為42h和0.0275mol/L時(shí)產(chǎn)酶量達(dá)到最高。其他無機(jī)離子對(duì)于α-淀粉酶發(fā)酵生產(chǎn)也有影響，如Ueno等［10］發(fā)現(xiàn)在利用Aspergillus oryzae生產(chǎn)α-淀粉酶過程中磷酸鹽對(duì)于初期的產(chǎn)酶和后續(xù)的次級(jí)代謝有十分重要的調(diào)控作用，研究發(fā)現(xiàn)，在磷酸鹽的濃度超過0.2mol/L時(shí)菌體數(shù)和酶的產(chǎn)量都有提高，而低于這個(gè)濃度時(shí)細(xì)胞密度和產(chǎn)酶量都有明顯下降，但是在高濃度的磷酸鹽培養(yǎng)基中，產(chǎn)酶量嚴(yán)重下降。

1.3 生長(zhǎng)因子對(duì)發(fā)酵生產(chǎn)的影響

Rajagopalan［11］等在研究利用 Bacillus subtilis KCC103進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)時(shí)發(fā)現(xiàn)一些微量的生長(zhǎng)因子對(duì)于產(chǎn)量有著重要的影響。有些氨基酸如組氨酸、纈氨酸、賴氨酸和酪氨酸對(duì)酶的產(chǎn)量起阻礙作用，而添加了0.03%的半胱氨酸后，產(chǎn)量增加了2倍。B族維生素添加到培養(yǎng)基后產(chǎn)量也有明顯提高，影響最大的是維生素B1和B6，當(dāng)添加0.02%的維生素B1后，產(chǎn)量提高2.35倍。一些表面活性劑對(duì)產(chǎn)量也有一定的影響，如SDS對(duì)產(chǎn)量起促進(jìn)作用，而其他的表面活性劑如吐溫20、吐溫-80等都對(duì)產(chǎn)量起阻礙作用。他們對(duì)上述因子進(jìn)行了優(yōu)化，在3%生土豆、2%酵母提取物、0.03%半胱氨酸、0.02%維生素 B1、0.02%SDS和0.5mmol/L MgSO4培養(yǎng)基中，36～48h后酶活最大為 537.7U/mL。Prakasham［12］等在研究Aspergillums awamori生產(chǎn)酸性α-淀粉酶的影響因素時(shí)發(fā)現(xiàn)，除了底物濃度和pH對(duì)酶產(chǎn)量的影響外，酪蛋白和MgSO4對(duì)于α-淀粉酶產(chǎn)量也有明顯的影響，在0.125%MgSO4和1.5%酪蛋白條件下，酶產(chǎn)量最高。

2 發(fā)酵條件的影響

2.1 溫度的影響

溫度在微生物的生長(zhǎng)和代謝過程中起著至關(guān)重要的作用。一般用于工業(yè)生產(chǎn)α-淀粉酶的菌株多為絲狀真菌和芽孢桿菌。多數(shù)生產(chǎn)α-淀粉酶的絲狀真菌最佳生長(zhǎng)溫度為25～37℃，一些生產(chǎn)耐高溫α-淀 粉 酶 的 真 菌，如 Talaromycesemersonii、Thermomonspora fusca和 Thermomyces lanuginosus等最適溫度在50～55℃;生產(chǎn)α-淀粉酶的芽孢桿菌，如Bacillus amyloliquefaciens、Bacillus subtilis、Bacillus licheniformis和Bacillus stearothermophilus的最適生長(zhǎng)溫度在37～60℃，一些產(chǎn)超耐熱α-淀粉酶的細(xì)菌如Thermococcus profundus和 Thermatoga maritima的最佳生長(zhǎng)溫度是 80℃［1］。一株工 程菌 Bacillus licheniformis NH1的最適溫度在37℃［13］，在一些產(chǎn)特殊性質(zhì)α-淀粉酶的細(xì)菌中，它們對(duì)溫度的要求更加苛刻，如一株產(chǎn)耐冷α-淀粉酶的細(xì)菌的最適溫度為4℃［8］。

2.2 pH的影響

pH在生產(chǎn)過程中是十分重要的參數(shù)。而且隨著發(fā)酵的進(jìn)行，一些代謝物的釋放會(huì)改變最初的生長(zhǎng)pH，這種變化同時(shí)也會(huì)對(duì)產(chǎn)物的穩(wěn)定性造成一定影響。通常真菌喜歡偏酸性的生產(chǎn)環(huán)境，而細(xì)菌在中性環(huán)境下生長(zhǎng)較好。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)一些曲霉屬的真菌如 Asperjillus oryzae、Asperjillus ficuum、和 Asperjillus niger在液體深層發(fā)酵過程中，當(dāng) pH在5.0～6.0時(shí)α-淀粉酶產(chǎn)量最高［14-16］。而細(xì)菌如Bacillus subtilis、Bacillus licheniformis和 Bacillus stearothermophilus需要的起始pH為7.0［1］。一些產(chǎn)耐酸性α-淀粉酶的細(xì)菌則需要在一個(gè)相對(duì)偏酸性的環(huán)境下才能達(dá)到最大產(chǎn)量，如Thermococcus profundus在pH4.5時(shí)產(chǎn)酶量最高［17］。Prakasham［12］等在研究Aspergillums awamori生產(chǎn)酸性α-淀粉酶的影響因素時(shí)發(fā)現(xiàn)，pH4.0時(shí)酶產(chǎn)量最高。

2.3 溶氧的影響

在一些耐高溫α-淀粉酶的生產(chǎn)過程中，生產(chǎn)菌株在對(duì)數(shù)期時(shí)強(qiáng)烈需氧，這一時(shí)期的供氧量成為菌體生長(zhǎng)的限制性因子，對(duì)于后來的產(chǎn)酶量有直接影響。林劍［18］等通過對(duì)一株α-淀粉酶生產(chǎn)菌株IIY-1液體發(fā)酵的研究發(fā)現(xiàn)，在對(duì)數(shù)期需要大量的溶氧，過了對(duì)數(shù)期后對(duì)氧氣的需求仍較大，保證對(duì)數(shù)期后的產(chǎn)酶階段溶氧不低于10%對(duì)于該菌株的耐高溫α-淀粉酶發(fā)酵順利進(jìn)行仍然是很重要的。在固態(tài)發(fā)酵中，Rahardjo等通過研究A.oryzae CBS570.64在低溶氧情況下的生長(zhǎng)狀態(tài)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)溶氧在1%時(shí)，菌絲生長(zhǎng)緩慢，當(dāng)降至0.25%時(shí)，菌絲的生長(zhǎng)明顯受限，同時(shí)發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)量嚴(yán)重下降;當(dāng)溶氧升至21%時(shí)，菌絲生長(zhǎng)迅速且發(fā)酵產(chǎn)物量也大大增加［19］。

3 結(jié)論與展望

α-淀粉酶在工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用十分廣泛。隨著人類對(duì)工業(yè)能耗的關(guān)注和重視，采用低廉的生物加工廢料和高效的加工工藝將是今后生產(chǎn)α-淀粉酶的首選方法。但是，α-淀粉酶發(fā)酵生產(chǎn)的影響因素很多，尤其是利用低廉的生物加工廢料進(jìn)行生產(chǎn)時(shí)影響因素更加復(fù)雜。除此之外，接種方式、生產(chǎn)工藝流程等也會(huì)對(duì)產(chǎn)量有很大影響。尹源明等［20］通過添加氧載體正十二烷提高發(fā)酵體系的氧氣傳遞速率從而促進(jìn)了發(fā)酵體系的產(chǎn)酶能力。在批量生產(chǎn)過程中接種的方式對(duì)結(jié)果也有很大的影響，Tari和Milner［21］等研究發(fā)現(xiàn)兩步接種法比一步法的產(chǎn)酶量要高。細(xì)胞的固定化技術(shù)也被應(yīng)用于α-淀粉酶的生產(chǎn)過程中，Konsoula［22］等將2%海藻酸鈣和3.5%CaCl2用于包埋地衣芽孢桿菌進(jìn)行α-淀粉酶的固定化生產(chǎn)，使產(chǎn)酶量提高了176%。因此，α-淀粉酶發(fā)酵生產(chǎn)的影響因素與酶產(chǎn)量之間有直接關(guān)系。對(duì)α-淀粉酶發(fā)酵生產(chǎn)的影響因素進(jìn)行研究和優(yōu)化，有利于進(jìn)一步降低α-淀粉酶發(fā)酵生產(chǎn)成本，提高生產(chǎn)效率，促進(jìn)α-淀粉酶發(fā)酵工業(yè)的發(fā)展。

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Research progress in influencing factors of fermentation conditions of α-amylase

WANG Shao-hui，CUI Zhi-feng*
(College of Biological and Environmental Engineering，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310032，China)

α-amylase has a broad spectrum of industrial applications as an industrial enzyme.In this review，factors that influence fermentation of α-amylase including temperature，pH，mental ions，trace elements，nitrogen and carbon sources，concentration of dissolved oxygen and fermentation process were summarized.

α-amylase;carbon and nitrogen sources;mental ions;trace elements;fermentation process

TS201.3

A

1002-0306(2011)03-0456-03

α-淀粉酶的系統(tǒng)命名為α-1，4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶(EC 3.2.1.1)，是重要的工業(yè)酶制劑，可以隨機(jī)切斷直鏈淀粉或支鏈淀粉中相鄰的α-1，4-糖苷鍵、將淀粉水解為糊精和一系列以葡萄糖為組成單位的低聚糖［1］。α-淀粉酶最早在 1811年由Kirchhoff發(fā)現(xiàn)，它廣泛分布于微生物、植物和動(dòng)物，但淀粉酶生產(chǎn)菌株主要來源于真菌和細(xì)菌，如Asperjillus aryzae、Bacillus subtilis、Bacilluss licheniformis等［2］。α-淀粉酶在現(xiàn)代工業(yè)生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用于酒精釀造、淀粉深加工、焙烤工業(yè)、啤酒釀造、紡織和醫(yī)藥工業(yè)［3-4］。由于利用α-淀粉酶進(jìn)行工業(yè)生產(chǎn)可以縮短生產(chǎn)周期、提高產(chǎn)品得率和原料利用率、減少能耗，越來越引起人們的關(guān)注。目前，工業(yè)上生產(chǎn)α-淀粉酶主要是通過微生物發(fā)酵的方法，其中可以分為固態(tài)發(fā)酵(SSF)和深層液體發(fā)酵(SmF)。固體發(fā)酵是一種培養(yǎng)基呈固態(tài)、利用自然底物作為碳氮源的發(fā)酵方法，對(duì)設(shè)備的要求較低。深層液體發(fā)酵相比于固體發(fā)酵方法有許多優(yōu)點(diǎn):先進(jìn)的生產(chǎn)工藝，大大提高了底物的利用率;生產(chǎn)周期短，質(zhì)量穩(wěn)定;機(jī)械化生產(chǎn)，提高了勞動(dòng)生產(chǎn)率。在工業(yè)生產(chǎn)中，發(fā)酵條件對(duì)α-淀粉酶產(chǎn)量有重要的影響。本文通過對(duì)近年來α-淀粉酶生產(chǎn)中的各種影響因素及優(yōu)化的研究成果進(jìn)行綜述，旨在為進(jìn)一步提高α-淀粉酶生產(chǎn)效率提供參考。

2010-02-08 *通訊聯(lián)系人

王紹輝(1985-)，男，碩士研究生，研究方向:生物技術(shù)。