曹艷萍，單安山，馬清泉，尹佳佳

東北農(nóng)業(yè)大學動物營養(yǎng)研究所，哈爾濱 150030

多拷貝策略在小肽表達中的應(yīng)用

曹艷萍，單安山，馬清泉，尹佳佳

東北農(nóng)業(yè)大學動物營養(yǎng)研究所，哈爾濱 150030

基因工程技術(shù)已經(jīng)在大分子多肽表達上得到了廣泛的應(yīng)用。但是小分子多肽不穩(wěn)定且易降解，使其表達后很難檢測和純化。多拷貝策略是將目的基因或是含有目的基因的表達盒首尾串聯(lián)，而串聯(lián)構(gòu)建多拷貝表達載體是目前解決小分子多肽表達量少的有效方法?？偨Y(jié)和比較非對稱粘性末端互補法、接頭連接法、同尾酶法和表達盒串聯(lián)法在多肽表達方面的應(yīng)用情況，為小分子多肽的體外表達提供方法和思路。

多拷貝，串聯(lián)，多肽表達，應(yīng)用

1 非對稱粘性末端互補構(gòu)建法的應(yīng)用

非對稱粘性末端互補構(gòu)建法是由限制性內(nèi)切酶(AvaⅠ、EcoT 14 I等) 切割目的基因兩端酶切位點產(chǎn)生的或人為設(shè)計的非對稱粘性末端相連形成的。載體和插入片段的摩爾比例以及連接時間不同，得到的多聚體的拷貝數(shù)也不同。此法具有連接效率高和操作簡單等優(yōu)點，且構(gòu)建的多聚體基因片段一般小于100 bp[4]。

Lee等[5]采用非對稱粘性末端法構(gòu)建了cGnRH-II的 4拷貝重組表達載體，并在大腸桿菌TOP10F中進行了表達。胡學軍等[6]以人工合成的胸腺素a1基因為模型，采用限制酶EcoT 14 I 識別序列CCAAGG為小肽兩末端序列，利用其酶切后產(chǎn)生非鏡像粘性末端，一次連接反應(yīng)就構(gòu)建出了一系列不同基因拷貝數(shù)的表達載體，并且在大腸桿菌BL21(DE3) 中都得到了高效表達。賈秀娟等[7]在對糖尿病合并癥有積極防治意義的C肽的兩端各設(shè)計了一個SfiⅠ(5'-GGCCNNNNNGGCC) 的酶切位點，酶切后產(chǎn)生非回文的粘性末端利于C肽基因片段的串聯(lián)，另外在C肽的兩端分別加上KpnⅠ、PstⅠ酶切位點，與經(jīng)KpnⅠ、PstⅠ酶切的載體PET-30a相連接，成功構(gòu)建了5拷貝的重組表達載體PET-30a-C5，經(jīng)轉(zhuǎn)化誘導表達后，融合蛋白占超聲上清總蛋白的40%~50%。除用特定的限制酶酶切產(chǎn)生非對稱粘性末端以外，也可以人工設(shè)計非對稱粘性末端。Tian等[8]根據(jù) LfcinB15-W4，10氨基酸序列，按照大腸桿菌密碼子偏愛性設(shè)計合成其編碼基因，人工設(shè)計非對稱粘性末端5'-CCGA/5'-TCGG，在T4 DNA連接酶作用下首尾串聯(lián)成1~7拷貝和9拷貝的多聚體編碼序列，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同拷貝數(shù)的多聚體基因序列都得到了特異性誘導表達，且四聚體融合蛋白表達水平最高，表達量為10 mg/L。Tian等[9]利用粘性末端法分別構(gòu)建了1~6拷貝的LH串聯(lián)基因，并且發(fā)現(xiàn)2拷貝在大腸桿菌E. coli C43中得到了高效表達，表達量為11.3 mg/L。Jain等[10]設(shè)計了帶有非對稱粘性末端的引物 (5'-TGGAATTCGCCCTTACGCGAT ATCCGTTAA/5'-GCCCCGGGACAAAAATTAGGAT CCAATCGCTAGCTGTGACAAGAGGTCGTTGCC)，克隆了編碼人gp41基因的保守區(qū)序列，并且構(gòu)建了3和5拷貝的重組表達載體。Wang等[11]同樣采用粘性末端互補法構(gòu)建了2、4、6、8拷貝的CAME表達載體，并對 4拷貝的重組表達載體進行了表達，表達量為86 mg/L。由此可見，粘性末端互補法也是構(gòu)建多拷貝過程中常用的方法和行之有效的方法之一，特別是適合于目的基因堿基數(shù)少的單體的多聚體的構(gòu)建，但是不同聚合度的多聚體的形成較隨機。

2 同尾酶法的應(yīng)用

同尾酶是指兩種不同的限制性內(nèi)切酶，它們可以識別不同的酶切位點而產(chǎn)生相同的粘性末端，例如 Bgl Ⅱ(5'-AGATCT) 和 BamHⅠ(5'-GGATCC)。利用這一性質(zhì)對重組載體進行單酶切和雙酶切，產(chǎn)生的線性化重組載體和插入片段具有相同的粘性末端，有助于多拷貝表達載體的構(gòu)建，同尾酶法在構(gòu)建多聚體的精確度上具有優(yōu)勢。

王震等[12]利用同尾酶的方法構(gòu)建了產(chǎn)甘油假絲酵母甘油合成關(guān)鍵酶基因CgGPD1的不同拷貝數(shù)的表達載體，并且研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)在相同的NaCl或葡萄糖質(zhì)量濃度下，胞漿3-磷酸甘油脫氫酶 (GPDH) 的活性隨著CgGPD1的拷貝數(shù)的增加而增加，但表達量沒有提高。馬精彩等[13]通過基因重組技術(shù)，將從pPIC9-Hirudin中擴增出的α-facor-Hirudin插入到載體 pAO815中，并構(gòu)建了多拷貝水蛭素重組表達載體 pAO815-(α-Hirudin)3，轉(zhuǎn)化GS115后得到了高效表達，表達量達1 600 U/mL，且表達產(chǎn)物具有良好的抗凝血活性。汪小福等[14]采用同尾酶的方法構(gòu)建了不同拷貝數(shù)的刺肩蝽 (Thanatin) 串聯(lián)融合表達載體，目的在于增加抗菌肽的表達豐度和抗菌肽的穩(wěn)定性。胡金川[15]同樣采用該法通過多次酶切、連接分別構(gòu)建了1~8拷貝的肽抗生素hPAB-β，并將其轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM109中進行了表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3拷貝的表達量最高且較穩(wěn)定。扈進冬等[16]利用同尾酶法成功構(gòu)建了天蠶素B基因 (Cecropin B) 的3拷貝表達載體，為Cecropin B的進一步研究和開發(fā)打下了基礎(chǔ)。Rao等[17]利用同尾酶法構(gòu)建了hPAB-β的2~8拷貝的多聚體，其中3拷貝的表達量為680 mg/L，比單體表達量提高了10倍多。同尾酶法在構(gòu)建多拷貝時雖然反復酶切連接較繁瑣，但是其構(gòu)建的多聚體較精確，利于后期的篩選。另外，為了避免反復酶切連接，也可以先將帶有同尾酶酶切位點的目的單體進行自連，利用雙酶切篩選構(gòu)建正確的多聚體再與載體相連，這樣就可以減少酶切和連接的次數(shù)。

3 接頭連接法的應(yīng)用

接頭連接法是以自帶粘性末端的接頭為媒介將目的基因連接在一起形成串聯(lián)的重復單元，從而達到構(gòu)建多拷貝表達載體的目的。該方法操作簡單，連接效率較高。蔣燕明等[18]分別設(shè)計了 4段 DNA片段XH1、XH2、EX1、EX2，退火連接形成2個接頭XH和EX，分別連到載體pPIC9K信號肽處的酶切位點XhoⅠ與EcoRⅠ之間，成功構(gòu)建了多拷貝表達載體 pPEX9K。Tian[19]設(shè)計了帶有 BamHⅠ和Hind Ⅲ酶切位點的接頭，成功構(gòu)建了2~7及9拷貝的LfcinB15-W4，10重組表達載體。Jiang等[20]采用接頭法成功構(gòu)建了 4~8拷貝的 CSEnc重組表達載體。接頭連接法操作簡單，通過控制連接時間和接頭的比例一次就能構(gòu)建不同拷貝數(shù)的多聚體。同非對稱粘性末端法一樣,該法也適用于分子量較小的單體。

4 表達盒串聯(lián)法的應(yīng)用

表達盒是指包括啟動子、信號肽、外源基因和終止子在內(nèi)的完整的表達調(diào)控序列。多拷貝表達盒串聯(lián)法是將完整的表達盒串聯(lián)，是表達盒的多拷貝，而不是目的基因的多拷貝，適用于二硫鍵數(shù)目較多的或是大分子蛋白的多拷貝構(gòu)建，降低了二硫鍵復性和構(gòu)象折疊的難度，通過此法構(gòu)建的多拷貝重組表達載體表達時，各個單一表達盒同時進行表達，表達產(chǎn)物是目的蛋白單體。

易俊波等[21]將腦鈉肽基因 (BNP) 連接到經(jīng)EcoRⅠ和BamHⅠ酶切的pCW111載體之后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌培養(yǎng)，提取質(zhì)粒用EcoRⅤ和SspⅠ酶切得到含有完整BNP的表達盒，另用EcoRⅤ單酶切所提質(zhì)粒，再用ALP去磷酸化，并將BNP表達盒與之連接構(gòu)建2和3拷貝表達載體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2拷貝的表達量高于 3拷貝的表達量，Mansur等[22]采用表達盒構(gòu)建法成功構(gòu)建了 4和 6拷貝的胰島素原(MPI) 重組表達載體，轉(zhuǎn)入畢赤酵母菌GS115中得到表達，最高表達量為259 mg/L。Lee等[23-25]同樣采用表達盒串聯(lián)法構(gòu)建了含有不同拷貝數(shù)的BuforinⅡ表達盒的重組表達載體，并將其轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21中進行了表達，結(jié)果顯示12拷貝的表達量最高，約為250 mg/L。表達盒串聯(lián)法更適用于大分子蛋白的多拷貝構(gòu)建。井申榮等[26]在體外構(gòu)建了人的白細胞介素-10的重組表達載體pAO815-aIL-10，并用BglⅡ和BamHⅠ雙酶切獲得目的基因重組表達盒(AOX-aIL-10)，再連接到BamHⅠ酶切位點處，依次構(gòu)建多拷貝重組表達載體pAO815-(AOX-aIL-10)n，結(jié)果發(fā)現(xiàn)4拷貝和8拷貝的重組表達載體在畢赤酵母中的表達量最高，為(8.25±1.65) mg/L。何成等[27]將表達盒 (5′AOXHBsAg-TT) 重復導入載體，成功構(gòu)建了乙肝表面抗原 (HBsAg) 的不同拷貝數(shù)的重組表達載體，經(jīng)轉(zhuǎn)化、誘導表達發(fā)現(xiàn)HBsAg表達量與拷貝數(shù)呈顯著正相關(guān) (t=8.714, P＜0.05)。Dheepak等[28]采用同樣的方法表達了紅酵母的環(huán)氧化物水解酶。由此可見，增加目的基因的拷貝數(shù)在一定程度上可以明顯提高其表達量。

5 多拷貝表達策略的研究展望

基因工程技術(shù)在食品、藥品、動物營養(yǎng)等各個領(lǐng)域已得到廣泛應(yīng)用，而小分子多肽的表達也成為了近幾年生物技術(shù)工作者所研究的熱點問題，但是由于小分子多肽自身所存在的問題使其表達量較少，因此，構(gòu)建多拷貝表達載體來解決這一問題顯現(xiàn)出了廣闊的前景。研究發(fā)現(xiàn)采用多拷貝策略在一定程度上能提高小分子多肽的表達量[29]，Kim等[30]構(gòu)建了2、4、8、12、16和32拷貝的Histonin表達載體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)12拷貝的表達量最高，可達168 mg/L。因此，通過對表達載體上游順式作用元件進行改造，構(gòu)建目的基因串聯(lián)表達方式為小分子多肽的高效表達提出了新的思路和方法。根據(jù)目的蛋白的大小和所含二硫鍵的數(shù)目選擇合適的多拷貝構(gòu)建方法，使目的蛋白的表達量有很大的提高，為目的基因異源表達的工業(yè)化生產(chǎn)提供技術(shù)支持。多拷貝表達策略雖然能在一定程度上提高目的蛋白的表達量，但也不是絕對的，即表達量和拷貝數(shù)不成正比，Zhong等[31]分別構(gòu)建了2、4、8拷貝的hBD2表達載體，并且在E. coli BL21中進行了表達，結(jié)果卻發(fā)現(xiàn)2拷貝的表達量最高，為760 mg/L。其具體原因和機理有待于進一步探討和研究。

以上 4種構(gòu)建多拷貝的方法并不是單獨存在的，它們之間有著一定的聯(lián)系。在利用表達盒方法構(gòu)建多拷貝時就可以在表達盒的兩端引入同尾酶，將表達盒首尾串聯(lián)起來后再直接連入表達載體，或者也可以通過接頭連入表達載體；另外，在采用接頭連接法構(gòu)建多拷貝時也可將同尾酶引入目的片段的兩端，連接構(gòu)建目的基因的多聚體后利用接頭將其連入表達載體；也可通過非對稱粘性末端法構(gòu)建目的基因的多聚體，再通過接頭將其連入載體。本課題組正采用同尾酶和接頭連接兩種方法構(gòu)建雞 β-防御素 6的多拷貝表達載體，有望得到高效表達。由此可見，根據(jù)蛋白的特性，選擇一種或結(jié)合兩種合適的構(gòu)建多拷貝方法對突破小肽表達量小的瓶頸有重大意義。

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Application of multi-copies in expression of smaller peptides: a review

Yanping Cao, Anshan Shan, Qingquan Ma, and Jiajia Yin

Institute of Animal Nutrition, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China

The technology of genetic engineering has been widely used to express macromolecules such as enzymes. However, it is difficult to detect and purify the micromolecules such as small peptides, because of their instability and degradability. Construction of multi-copy recombinant expression plasmid can be achieved by inserting multiple target genes or expression cassette containing target genes with the same orientation into expression vector. This is effective to increase the expression level of small peptides. In this article we described four methods in order to provide some optional methods and ideas for the expression of active small peptides.

multi-copies, in series, expression of polypeptides, application

近年來，隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，一些有生物活性的小分子多肽受到了高度的重視，國內(nèi)外針對小分子多肽的大量研究表明某些小肽在動物營養(yǎng)保健、生物制藥和臨床應(yīng)用等方面有著廣闊的前景。但是由于其分子量小，在細胞中的穩(wěn)定性不好，容易被宿主蛋白酶識別并降解為無活性的寡肽片段[1]，另外其表達量也少，在一定程度上制約了小分子多肽的工業(yè)化生產(chǎn)。目前，采用構(gòu)建多拷貝表達載體的策略可以有效提高小分子多肽的表達量和穩(wěn)定性。Shang等[2]分別構(gòu)建了2、4和8拷貝的K6W-泛素重組表達載體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)表達量隨拷貝數(shù)的增加而增加。多拷貝表達載體的構(gòu)建方法主要有非對稱粘性末端互補法、接頭連接法、同尾酶法和表達盒串聯(lián)法4種，每一種的構(gòu)建方法和適用范圍各不相同，應(yīng)根據(jù)實際情況選擇適合的方法構(gòu)建多拷貝基因表達載體。除此之外，也可采用含有卡那霉素抗性基因的表達載體pPIC3.5K和pPIC9K，通過增加的抗遺傳霉素抗性，在體內(nèi)篩選多拷貝插入子。Wang等[3]采用該法使人α-防御素-5的成熟肽得到了高效表達。本文對多拷貝策略的應(yīng)用進行了分析和歸納，旨在為人們進一步認識和利用多拷貝策略提供參考。

October 23, 2010; Accepted: January 5, 2011

Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 31072046), Research Fund for the Doctoral Program of Higher Education of China (No. 20092325110009), Scientific Research Fund of Heilongjiang Provincial Education Department (No. 11551z003).

Anshan Shan. Tel: +86-451-55190685; E-mail: asshan@mail.neau.edu.cn

國家自然科學基金 (No. 31072046)，高等學校博士學科點專項科研基金 (No. 20092325110009)，黑龍江省教育廳科學技術(shù)研究項目 (No. 11551z003) 資助。