陳 原，肖冬光

(天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院工業(yè)微生物教育部重點實驗室，天津300457)

發(fā)酵法制備S-腺苷-L-甲硫氨酸的研究進展

陳 原，肖冬光*

(天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院工業(yè)微生物教育部重點實驗室，天津300457)

S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)是甲硫氨酸和ATP相結(jié)合的代謝產(chǎn)物，廣泛存在于動植物和微生物體內(nèi)，參與40多種生化反應(yīng)，臨床上被廣泛用于治療肝病、抑郁癥、關(guān)節(jié)炎等。SAM制備方法包括化學(xué)合成法、微生物發(fā)酵法、體外酶促轉(zhuǎn)化法以及全細胞催化法。詳細闡述了SAM的微生物發(fā)酵制備方法的國內(nèi)外研究現(xiàn)狀。

S-腺苷-L-甲硫氨酸，微生物發(fā)酵法，研究進展

1 誘變菌株發(fā)酵生產(chǎn)SAM

1.1 篩選高產(chǎn)菌株

根據(jù)shiozaki等人［6］的研究發(fā)現(xiàn)，清酒酵母相對于其它酵母屬菌株能積累更多的SAM。因此國內(nèi)北京化工大學(xué)［8］、西南大學(xué)［9］都將清酒酵母作為誘變出發(fā)菌株。對于誘變手段，有采用紫外誘變、γ射線誘變、紫外氯化鋰復(fù)合誘變、NTG誘變，還有采用航空誘變。誘變篩子目前采用DL-乙硫氨酸［10-12］和制霉菌素［10，13］較多。初篩方法有采用紫外分光光度法，還有采用紙層析法。復(fù)篩方法通常為HPLC法。所得的誘變菌株相對于出發(fā)菌株都有不同程度的提高。

國外對于誘變篩選高產(chǎn)菌報道相對較少。其中K.P.Mincheva等［11］通過N-甲基-N-硝基-N'-亞硝基胍(NTG)誘變，DL-乙硫氨酸抗性篩選得到一株富含SAM的乳糖利用型的克魯維酵母AM-65?？砂l(fā)酵乳清生產(chǎn)SAM。Petra.C.Heiland和Frank.F.Hill［12］通過紫外誘變，DL-乙硫氨酸抗性篩選得到一株富含SAM的面包酵母突變株325。

1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件的優(yōu)化

國內(nèi)北京化工大學(xué)主要做高密度發(fā)酵工藝的優(yōu)化，考察了補糖中添加磷酸氫二銨、谷氨酸鈉、三磷酸腺苷二鈉來提高釀酒酵母發(fā)酵后期的穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵34h左右，菌體干重超過100g/L后，開始添加50g L-甲硫氨酸，并在補糖中加入10g/L三磷酸腺苷二鈉，發(fā)酵65.7h，SAM產(chǎn)量達到了17.1g/L［14］。

另外浙江大學(xué)考察了利用廢啤酒酵母或釀酒酵母ZJUS1來同時生產(chǎn)SAM和谷胱甘肽［15］。

國外 K.P.Mincheva等［16］對乳清培養(yǎng)基進行優(yōu)化，得到最佳的乳清培養(yǎng)基為含4g/L乳糖，3.1g/L硫酸銨，12.7g/L玉米浸出液，4.6g/L的L-甲硫氨酸的脫蛋白乳清液。培養(yǎng)20h后，細胞干重為14.2g/L。SAM的含量在26h后達到最大為90mg/g。因為其他變量(pH，溶氧濃度等)可能也是SAM生產(chǎn)的關(guān)鍵，因此K.P.Mincheva等［17］又對發(fā)酵條件進行優(yōu)化，得到最佳發(fā)酵條件為 28.5℃，pH為 5.3，轉(zhuǎn)數(shù)為270r/min。在最佳條件下培養(yǎng)20h，所得SAM產(chǎn)量為1.55g/L。

S.Shiozaki等［18］對培養(yǎng)基進行了優(yōu)化，得到最適培養(yǎng)基為10%蔗糖，1.8%尿素，1%酵母提取物，0.75%～1.5%L-甲硫氨酸。另外在培養(yǎng)基中添加甘氨酸、生物素和CaCl2都有利于SAM的積累。在最優(yōu)條件下進行發(fā)酵，所得SAM的產(chǎn)量為10.8g/L，含量為260mg/g。S.Shiozaki等［19］還對培養(yǎng)條件進行了研究，發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)速為500r/min或蔗糖流加時S.sake K-6的生長速率相對于轉(zhuǎn)速為300r/min或乙醇流加時要大，而在轉(zhuǎn)速為500r/min或蔗糖流加時SAM的含量相對于轉(zhuǎn)速為300r/min或乙醇流加時要小。

1.3 分離純化及穩(wěn)定性鹽的制備

由于SAM是胞內(nèi)物質(zhì)，要得到產(chǎn)物SAM，首先必需破碎酵母細胞，將其釋放出來，然后利用離心或過濾的方法將上清液和細胞碎片進行分離。國內(nèi)曾俊華等［20］考察了不同細胞破碎方法對酵母釋放S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)的影響，結(jié)果表明用乙酸乙酯處理細胞，再利用0.35mol/L硫酸破壁可以使90%以上的SAM從酵母中釋放出來。

由于破壁分離所得的上清液中存在著其它雜質(zhì)，必需將它們除去。一般采用兩種方法，一種是用選擇性沉淀劑對SAM進行選擇性沉淀。另一種是用陽離子交換樹脂進行吸附，然后對其進行洗脫即可得到SAM產(chǎn)物。

Shiozaki等［21］分離提取SAM的方法為首先對酵母進行破碎，采用冷凍融化進行破碎，所得的上清液首先通過安伯來特IRA-45(OH-)，過濾除去樹脂后的濾液再過安伯來特XAD-2，直接通過樹脂的部分再過安伯來特IRC-50(H-)，此柱用0.005N硫酸進行洗脫，直到洗脫液在258nm處的吸光度值小于0.2，再用0.1mol/L硫酸進行洗脫，將SAM洗脫下來。在洗脫液中加入冰丙酮和甲醇混合液(75∶25，v/v)，通過離心收集沉淀。沉淀用冰丙酮洗滌然后溶解在水中，最后凍干即得產(chǎn)物。

在分離純化過程中由于SAM不穩(wěn)定，會發(fā)生分解，因此需要降低pH和溫度抑制其分解，此外還需將其制備成鹽。趙曉星［22］對穩(wěn)定性鹽的制備進行了研究，分別制取了硫酸鹽，對甲苯磺酸硫酸雙鹽以及1，4-丁二磺酸二鈉鹽。

2 重組菌發(fā)酵生產(chǎn)SAM

由于誘變育種的不定向性，因此通過基因工程和代謝工程方法提高SAM產(chǎn)量成為研究熱點。對于SAM生產(chǎn)菌的遺傳改造主要有以下5種途徑。

2.1 高效表達腺苷甲硫氨酸合成酶SAM2

通過高效表達無產(chǎn)物抑制現(xiàn)象的釀酒酵母腺苷甲硫氨酸合成酶SAM2可以提高細胞內(nèi)總的SAM合成酶的活性，從而提高SAM的產(chǎn)量。Zhang等［23］將來源于釀酒酵母的SAM合成酶基因SAM2置于AOX1啟動子的下，構(gòu)成表達質(zhì)粒，質(zhì)粒載體為pPIC9K(α信號肽被切除)，并轉(zhuǎn)化入畢赤酵母GS115，在搖瓶中考察了甲醇添加量和細胞密度對SAM產(chǎn)量的影響。當(dāng)添加2%甲醇和細胞密度為30.90g干細胞/L時，SAM產(chǎn)量最高為1.29g/L。此外又考察了發(fā)酵過程中NH+4濃度對SAM產(chǎn)量的影響，當(dāng)濃度為 450mmol/L時，生產(chǎn)率最大為0.248g/L，同時在非常短的誘導(dǎo)時間(47h)，3.7L發(fā)酵罐內(nèi)SAM的產(chǎn)量達到11.63g/L［24］。由于AOX1啟動子調(diào)控SAM合成酶表達時，在甲醇誘導(dǎo)期會發(fā)生胞內(nèi)ATP供應(yīng)不足。因此HU等［25］嘗試采用甲醇和甘油交替補料，但甘油會抑制SAM合成酶表達。為實現(xiàn)同時保持SAM合成酶的表達和補入甘油提高胞內(nèi)ATP水平，呂中原等［26］設(shè)計同時利用 AOX1和GAP啟動子在同一重組菌內(nèi)調(diào)控 SAM2表達的策略。

國外Eun-Sil Choi等［27］對工業(yè)菌株S.cerevisiae sake K6進行紫外誘變得到一株亮氨酸缺陷型菌株K6-1，該突變株的生長速率和SAM的產(chǎn)量與出發(fā)菌株相當(dāng)。使用亮氨酸缺陷作為遺傳標記，在突變株中過量表達SAM2，提高了所得重組菌的SAM產(chǎn)量。Sang-Woo Lee等［28］對上述亮氨酸缺陷型菌株又進行了基因改造。將SAM2和ERC1基因片段導(dǎo)入，使S. cerevisiae sake K6的SAM產(chǎn)量進一步提高。SAM的含量達到了細胞干重的一半。Shiomi等［29］將乙硫氨酸抗性基因轉(zhuǎn)入細胞內(nèi)，重組菌的DL-乙硫氨酸抗性明顯增加而且SAM的產(chǎn)量也明顯增加。隨后對此抗性基因的限制性酶切圖譜進行分析發(fā)現(xiàn)，此基因可能為SAM2。Shiomi等［30］為了進一步提高SAM的產(chǎn)量，將此乙硫氨酸抗性基因整合到酵母染色體中，發(fā)現(xiàn)SAM的產(chǎn)量是乙硫氨酸抗性基因整合在染色體外多拷貝質(zhì)粒時的兩倍。

2.2 切斷SAM轉(zhuǎn)化為半胱氨酸的途徑

通過敲除胱硫醚β-合成酶(CBS)基因，可切斷SAM轉(zhuǎn)化為半胱氨酸的途徑，從而增加細胞內(nèi)SAM的積累。He等［31］對畢赤酵母GS115進行了以下3種方式改造，一種為導(dǎo)入腺苷甲硫氨酸合成酶SAM2，所得重組菌株Gsam的SAM產(chǎn)量是原始菌的20倍，另一種為敲除胱硫醚合成酶基因CBS，所得重組菌的SAM產(chǎn)量為原始菌的兩倍，還有一種將上述兩種策略進行結(jié)合，所得重組菌Gsam-cbs的SAM產(chǎn)量比原始菌株提高了56倍，首次報道了基因?qū)牒颓贸赟AM生產(chǎn)中的協(xié)同效應(yīng)。重組菌Gsamcbs在搖瓶中SAM最高產(chǎn)量為3.6g/L，在5L發(fā)酵罐中SAM最高產(chǎn)量達到13.5g/L。鄧娟娟［32］又對該菌種的發(fā)酵工藝進行了系統(tǒng)的研究和優(yōu)化，在5L發(fā)酵罐中SAM平均產(chǎn)量達到了15g/L，將發(fā)酵規(guī)模擴大到20L，并對工藝做了相關(guān)改進，SAM產(chǎn)量達到了22g/L左右。

2.3 解除SAM對甲叉四氫葉酸還原酶的反饋抑制

釀酒酵母的甲叉四氫葉酸(MTHFR)有2個同功酶Met12p和Met13p，其中Met13p同功酶是其活性的主要來源［33］，催化5，10-甲叉四氫葉酸生成5-甲基四氫葉酸。5-甲基四氫葉酸和高半胱氨酸合成甲硫氨酸，而甲硫氨酸是SAM合成的前體。Sanja Roje等［34］使用代謝工程的方法在釀酒酵母中證明了MTHFR在體內(nèi)受SAM的抑制。通過構(gòu)建了一個由Met13p的N端催化部位以及擬南芥MTHFR的C端調(diào)控部分構(gòu)成的嵌合MTHFR(Chimera-1)取代釀酒酵母原有的MTHFR，結(jié)果顯示構(gòu)建的重組酵母SCY4積累的SAM以及甲硫氨酸分別比野生酵母提高了140倍和7倍。說明SAM在體內(nèi)對MTHFR有反饋抑制的作用。同時也證明了解除SAM對MTHFR反饋抑制來提高SAM產(chǎn)量的可行性。隨后又發(fā)現(xiàn)SCY4在含甘氨酸和甲酸鹽的培養(yǎng)基中生長時，SAM高量積累，但當(dāng)添加物換成絲氨酸時，SAM不再高量積累［35］。

2.4 切斷SAM生成麥角固醇的途徑

通過敲除麥角固醇合成過程中有關(guān)的酶基因，來阻斷SAM的去路，從而提高SAM的產(chǎn)量。Megumi Shobayashi等［13］做了相關(guān)的研究，首先對出發(fā)菌株S.cerevisiae K-9和X2180-1進行紫外誘變，用制霉菌素作為篩子進行篩選，以期篩選到SAM產(chǎn)量高的突變株。結(jié)果篩選到的高產(chǎn)SAM的突變株其SAM的產(chǎn)量是出發(fā)菌株的1.7～5.5倍，同時麥角固醇的含量減少。對K-9的兩株突變株進行NMR和GC-MS分析顯示，這兩株突變株的突變位置在erg4，因此推測erg4的突變可以使釀酒酵母的SAM產(chǎn)量提高。為了證明這一點，分析了敲除erg4基因的酵母菌株及其出發(fā)菌株的SAM產(chǎn)量和麥角固醇的含量，結(jié)果證明了erg4缺陷的突變株可以高產(chǎn)SAM。因此通過敲除麥角固醇合成過程中的有關(guān)基因可提高SAM產(chǎn)量。

2.5 對腺苷甲硫氨酸合成酶進行 DNA shuffling改造

采用DNA shuffling技術(shù)，提高腺苷甲硫氨酸合成酶的活性，從而提高SAM的產(chǎn)量。國內(nèi)Hu等［36］采用此技術(shù)對大腸桿菌、釀酒酵母和鏈霉菌的腺苷甲硫氨酸合成酶進行重新洗牌得到重組腺苷甲硫氨酸合成酶，將其轉(zhuǎn)入GS115。篩選到兩株高腺苷甲硫氨酸酶活性和高產(chǎn)SAM的重組菌。對最佳的重組菌GS115/DS56進行500L發(fā)酵，產(chǎn)量為6.14g/L。隨后又對此菌株的L-甲硫氨酸補料策略進行優(yōu)化［37］。

3 結(jié)論

隨著SAM在醫(yī)藥工業(yè)中的廣泛應(yīng)用及其需求量的不斷增加，建立廉價有效的生產(chǎn)方法已是迫在眉睫。首先在菌種選育方面，由于前體物L(fēng)-甲硫氨酸的價格昂貴，所以可以考慮通過基因工程的方法構(gòu)建可利用價格低廉的前體物來生產(chǎn)SAM的菌株，其次在發(fā)酵方面，可嘗試開發(fā)低廉的原料作為發(fā)酵培養(yǎng)基，同時對于高密度發(fā)酵的補料策略也可以進行進一步的研究，縮短其發(fā)酵時間，提高前體物的轉(zhuǎn)化率，最后在分離純化及穩(wěn)定性鹽的制備方面，應(yīng)減少分離純化步驟，從而減少其制備過程中的損失，同時開發(fā)更加安全穩(wěn)定的鹽。

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Research progress in S-adenosyl-L-methionine producing with fermentation

CHEN Yuan，XIAO Dong-guang*
(Tianjin University of Science and Technology，College of Biotechnology，Key Laboratory of Industrial Microbiology，Ministry of Education，Tianjin 300457，China)

S-adenosyl-L-methionine(SAM)was a metabolite that results from the combination of methionine and ATP.It widely existed in plants，animals，microorganisms and participates in more than 40 kinds’biochemical reactions.It had remarkable curative effect on liver disease，depression，arthritis and many other diseases.The preparation methods of SAM included chemical synthesis，microbial fermentation，enzymatic synthesis in vitro and whole-cell catalytic method.It elaborated on the current status of microbial fermentation at home and abroad.

S-adenosyl-L-methionine;microbial fermentation;research progress

TS201.2

A

1002-0306(2011)09-0435-04

S-腺苷-L-甲硫氨酸(S-adenosyl-LMethionine，SAM)是廣泛存在于生物體內(nèi)、具有重要生理活性的一種代謝中間體，對于肝?。?］、抑郁癥［2］、關(guān)節(jié)炎［3］等疾病具有顯著療效。1999年美國FDA批準SAM作為保健品上市，現(xiàn)在已經(jīng)成為一種暢銷的保健品。我國肝炎、關(guān)節(jié)炎以及抑郁癥患者眾多，對SAM的需求量較大。但目前國內(nèi)僅海正藥業(yè)一家可以生產(chǎn)SAM。SAM的生產(chǎn)方法有化學(xué)合成法、微生物發(fā)酵法、體外酶促轉(zhuǎn)化法以及全細胞催化法［4］。工業(yè)化生產(chǎn)SAM的主要方法是微生物發(fā)酵法。本文詳細闡述了微生物發(fā)酵法的國內(nèi)外研究現(xiàn)狀。微生物發(fā)酵法是基于酵母屬菌株含有液泡，相對于其它微生物具有較強的積累SAM能力［5-7］，因此可利用這些菌株在含有L-甲硫氨酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，積累較高濃度的SAM。通過這些酵母菌株的大規(guī)模發(fā)酵及后期的提取精制，可獲得具有生物活性的SAM。根據(jù)所采用的菌株，可將微生物發(fā)酵法分為兩類:一類是誘變菌株的微生物發(fā)酵，另一類是重組菌株的微生物發(fā)酵。

2010-09-13 *通訊聯(lián)系人

陳原(1987-)，男，碩士研究生，研究方向:微生物發(fā)酵。