杜郁，王麗，王麗非，司書(shū)毅，楊媛，洪斌

·論著·

以Apo A-I為靶點(diǎn)的基因表達(dá)上調(diào)劑篩選模型的建立

杜郁，王麗，王麗非，司書(shū)毅，楊媛，洪斌

目的建立靶向人 Apo A-I 轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列的高通量藥物篩選模型，用于篩選 Apo A-I 基因表達(dá)上調(diào)劑。

載脂蛋白 A-I； 轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子； 熒光素酶類(lèi)； 藥物評(píng)價(jià)，臨床前

www.cmbp.net.cn 中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù), 2011, 6(3):178-183

高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）水平降低是心血管疾病的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素，它和動(dòng)脈粥樣硬化疾病的發(fā)生存在明確的負(fù)相關(guān)關(guān)系[1]。研究發(fā)現(xiàn)，HDL-C 的水平每增加 1 mg/dl，心血管病發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)可降低 2％ ～3％[2]。隨著研究的深入，目前傾向認(rèn)為高密度脂蛋白（HDL）的心血管保護(hù)作用很大程度上依賴(lài)于它所介導(dǎo)的膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)（reverse cholesterol transport，RCT）過(guò)程，即 HDL 將膽固醇從周?chē)M織（包括粥樣斑塊）轉(zhuǎn)運(yùn)到肝臟以膽酸形式代謝[3]。因此，提高和改善 HDL 水平與功能，有可能成為動(dòng)脈粥樣硬化治療的新途徑。

載脂蛋白 A-I（apolipoprotein A-I，Apo A-I）是 HDL 的主要結(jié)構(gòu)蛋白和功能單位，與 HDL 的形成密切相關(guān)。Apo A-I 在血漿中的濃度與 HDL-C的水平相關(guān)，可通過(guò)多種機(jī)制發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化作用[4]，有望成為動(dòng)脈粥樣硬化的治療靶基因之一。通過(guò)對(duì)肝細(xì)胞中 Apo A-I 基因調(diào)控區(qū)缺失圖譜和轉(zhuǎn)基因鼠的研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄起點(diǎn) –220 ～ –110 bp 的啟動(dòng)子區(qū)域存在幾個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，包括 Site A（–214 ～ –192 bp）、Site B（–169 ～ –146 bp）和 Site C（–134 ～ –119 bp），對(duì)于維持肝細(xì)胞中 Apo A-I 的正常轉(zhuǎn)錄和表達(dá)是必需的[5]。本研究以上述Apo A-I 的啟動(dòng)子序列為靶點(diǎn)，利用報(bào)告基因體系，建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞用于基因表達(dá)上調(diào)劑的高通量篩選。將 Apo A-I 基因上游的 –277 ～ +173 bp 片段克隆于熒光素酶報(bào)告基因的上游，得到受 Apo A-I 基因啟動(dòng)子調(diào)控的重組報(bào)告基因表達(dá)質(zhì)粒，并獲得了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 HepG2 細(xì)胞的單克隆細(xì)胞株，經(jīng)篩選條件優(yōu)化和評(píng)價(jià)，建立了針對(duì)人 Apo A-I 的基因表達(dá)上調(diào)劑藥物篩選模型。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1質(zhì)粒、菌株和細(xì)胞株 真核細(xì)胞表達(dá)載體pGL4.17（luc2/Neo）和質(zhì)粒載體 pGEM-T為美國(guó)Promega 公司產(chǎn)品；大腸桿菌 E. coli TG1 為本實(shí)驗(yàn)室保存；人肝癌細(xì)胞株 HepG2 為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2工具酶和主要試劑 限制性?xún)?nèi)切酶、T4 DNA 連接酶等均購(gòu)自大連寶生物工程公司；PfuDNA 聚合酶購(gòu)自上海生工生物工程公司；DNA回收試劑盒購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；中量質(zhì)粒提取試劑盒（PureYield? Plasmid Midiprep System）、細(xì)胞裂解液和熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)（Luciferase Assay System）購(gòu)自美國(guó) Promega 公司；轉(zhuǎn)染試劑（Lipofectamine? 2000）購(gòu)自美國(guó) Invitrogen 公司；MEM 細(xì)胞培養(yǎng)基為美國(guó) Thermo 公司產(chǎn)品；胎牛血清、丙酮酸鈉、非必需氨基酸和 G418 抗生素為美國(guó) Gibco 公司產(chǎn)品；二甲基亞砜（DMSO）購(gòu)自美國(guó) Sigma 公司。

1.1.3儀器 MiniCycle PTC-200 型 PCR 儀為美國(guó) MJ Research 公司產(chǎn)品；EnVision 多功能微孔板檢測(cè)儀為美國(guó) PerkinElmer 公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1DNA 目的片段的體外擴(kuò)增、克隆及測(cè)序 從人肝癌細(xì)胞株 HepG2 中抽提獲得基因組DNA，并以此為模板，根據(jù) GenBank 上所收錄的Apo A-I 基因序列（GeneID：335）和文獻(xiàn)[5]報(bào)道的人 Apo A-I 基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件所在位置，通過(guò)Primer Premier 5.0 設(shè)計(jì) PCR 上游引物 5’ TACTC GAG AGTGCAGGGAACCCCGACC 3’（下劃線表示 Xho I 酶切位點(diǎn)）和下游引物 5’ ATAAGCTT AT GCAGAAGCCCCGTGCTCC 3’（下劃線表示Hind III 酶切位點(diǎn)），擴(kuò)增位于 –277 ～ +173 bp 區(qū)域的人 Apo A-I 基因啟動(dòng)子序列。PCR 體系反應(yīng)條件為 94 ℃ 變性 5 min；94 ℃ 變性 50 s，57 ℃ 退火 50 s，72 ℃ 延伸 60 s（30 個(gè)循環(huán)）；72 ℃ 延伸 10 min。

將 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物純化回收，與 pGEM-T 載體連接，轉(zhuǎn)化至 E. coli TG1 感受態(tài)宿主菌，用藍(lán)白斑法挑選轉(zhuǎn)化子。提取純化質(zhì)粒，酶切鑒定陽(yáng)性克隆，將含有預(yù)期大小片段的重組質(zhì)粒命名為pGEM-ApoP，測(cè)序鑒定插入片段的 DNA 序列。

1.2.2重組質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定 Xho I 和 Hind III酶切重組質(zhì)粒 pGEM-ApoP 和 pGL4.17 質(zhì)粒，將目的基因片段與雙酶切后的線性 pGL4.17 質(zhì)粒連接，從而將人 Apo A-I 基因上游啟動(dòng)子序列定向插入到 pGL4.17 載體的熒光素酶報(bào)告基因上游，構(gòu)建完成重組質(zhì)粒 pGL4-ApoP。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至 E. coli TG1 中增殖擴(kuò)增，提取質(zhì)粒并用 Xho I 和Hind III 進(jìn)行雙酶切鑒定。

1.2.3細(xì)胞培養(yǎng) HepG2 細(xì)胞培養(yǎng)于含 10％ 胎牛血清的 MEM 培養(yǎng)基中，添加 1 mmol/L 丙酮酸鈉和 1％ 非必需氨基酸，37 ℃、5％ CO2條件下培養(yǎng)。0.25％ 胰酶加 0.02％ 乙二胺四乙酸（EDTA）消化傳代。

1.2.4重組質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染與轉(zhuǎn)染條件優(yōu)化 轉(zhuǎn)染用質(zhì)粒的提取方法按 PureYield? Plasmid Midiprep System 試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。轉(zhuǎn)染前一天，于 30 mm培養(yǎng)皿接種 8 × 105個(gè) HepG2 細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)匯聚程度達(dá)到 80％ 左右時(shí)，按 Lipofectamine?2000 說(shuō)明書(shū)操作，將 pGL4-ApoP 經(jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染至 HepG2 細(xì)胞。24 h 后，得到瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，并測(cè)定熒光素酶的表達(dá)活性。同時(shí)按照 DNA 和轉(zhuǎn)染劑兩者比例（μg/μl）為 1:1、1:2、1:2.5、1:3 和1:4考察轉(zhuǎn)染效率。

1.2.5穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的構(gòu)建 將瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞以 5 × 103個(gè)細(xì)胞/孔接種于 96 孔板，置于 37 ℃、5％ CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，以含 G418 700 μg/ml 的 MEM選擇培養(yǎng)液篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，每 3 ～ 4 天換液一次。兩周后，選擇存活的細(xì)胞集落進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，測(cè)定熒光素酶的表達(dá)活性，將活性較高的細(xì)胞集落通過(guò)有限稀釋法，篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的單克隆細(xì)胞株，經(jīng)多次傳代培養(yǎng)后熒光素酶的表達(dá)活性無(wú)明顯降低者可確定為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株 ApoP-Luc HepG2。

1.2.6化合物篩選流程及模型評(píng)價(jià) 將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞用含 G418 700 μg/ml 的 MEM 選擇培養(yǎng)液調(diào)節(jié)至 5 × 105個(gè)/ml，接種于 96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔 100 μl，37 ℃、5％ CO2培養(yǎng) 6 h 后，吸棄培養(yǎng)液上清，更換無(wú)血清 MEM 培養(yǎng)液，并加入待篩化合物或 DMSO 對(duì)照，孵育 20 h。吸棄細(xì)胞培養(yǎng)液上清，PBS 洗滌細(xì)胞 2 次，每孔加入 20 μl 細(xì)胞裂解液，37 ℃ 孵育 15 min 以充分裂解，加入Luciferase Assay System 中提供的熒光素酶檢測(cè)液后，通過(guò) EnVision 微孔板多功能檢測(cè)儀讀取熒光素酶活性數(shù)值。以熒光素酶的表達(dá)活性來(lái)考察化合物對(duì) Apo A-I 基因表達(dá)的上調(diào)作用。熒光素酶活性的評(píng)價(jià)采用調(diào)節(jié)率來(lái)定義：調(diào)節(jié)率 =（樣品組細(xì)胞熒光素酶活性/DMSO 組細(xì)胞熒光素酶活性）× 100％，本研究將化合物樣品的調(diào)節(jié)率大于 150％定義為初篩陽(yáng)性。

為評(píng)價(jià)所構(gòu)建模型的有效性，將已知陽(yáng)性化合物染料木素（Genistein）制成不同濃度作用于細(xì)胞模型，檢測(cè)其對(duì)熒光素酶表達(dá)活性的影響。同時(shí)為評(píng)價(jià)此篩選模型對(duì)高通量篩選的可用性，對(duì)信號(hào)/背景比（S/B）、信號(hào)/噪音比（S/N）和變異系數(shù)（CV）進(jìn)行檢測(cè)，按 Zhang 等[6]的方法計(jì)算 Z’ 因子，公式如下所示：Z’= 1 －（3 × 陽(yáng)性對(duì)照孔 SD + 3 ×空白對(duì)照孔SD）/（陽(yáng)性對(duì)照孔平均值 － 空白對(duì)照孔平均值）。

1.2.7化合物篩選條件優(yōu)化 化合物溶于 DMSO中，作用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的濃度為 10 μg/ml。為優(yōu)化篩選條件，考察了溶劑 DMSO 濃度以及化合物作用時(shí)間對(duì)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞熒光素酶表達(dá)活性的影響。

2 結(jié)果

2.1 Apo A-I 基因啟動(dòng)子序列的獲得

以人基因組 DNA 為模板，PCR 擴(kuò)增得到人Apo A-I 基因啟動(dòng)子序列，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，顯示獲得預(yù)期大小的 DNA 片段（圖 1A）。

將以上 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物克隆至 pGEM-T 載體中，對(duì)重組質(zhì)粒的插入片段進(jìn)行序列測(cè)定，結(jié)果表明所插入片段均與 GenBank 中所登錄的序列（登錄號(hào)：NG_012021.1）一致，符合 Apo A-I 基因上游啟動(dòng)子序列的預(yù)期設(shè)計(jì)。

2.2 報(bào)告基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建

圖1 ApoA-I 基因啟動(dòng)子序列的 PCR 擴(kuò)增和 pGL4-ApoP酶切鑒定結(jié)果Figure 1 PCR product of human Apo A-I gene promoter and restriction enzymatic analysis of recombinant plasmid pGL4-ApoP

對(duì)構(gòu)建的重組質(zhì)粒 pGL4-ApoP 進(jìn)行酶切鑒定，結(jié)果顯示，Apo A-I 基因上游啟動(dòng)子序列以正確的方向插入到 pGL4.17 中熒光素酶報(bào)告基因的上游（圖 1B）。

2.3 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的建立

擴(kuò)增得到的 ApoA-I 基因上游啟動(dòng)子序列含有 –220 ～ –110 bp 區(qū)域的幾個(gè)重要轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，對(duì)于在 HepG2 細(xì)胞中 Apo A-I 基因的正常表達(dá)非常關(guān)鍵。熒光素酶表達(dá)活性檢測(cè)結(jié)果顯示，相比未插入啟動(dòng)子序列的 pGL4.17 質(zhì)粒，報(bào)告基因質(zhì)粒 pGL4-ApoP 的熒光素酶表達(dá)活性明顯增高。同時(shí)通過(guò)優(yōu)化重組質(zhì)粒 DNA 和轉(zhuǎn)染試劑兩者比例，確定當(dāng) DNA: Lipofectamine? 2000 兩者比例為 1:3 時(shí)，轉(zhuǎn)染效率最高（圖2，n = 3）。

圖2 轉(zhuǎn)染試劑濃度對(duì)重組質(zhì)粒熒光素酶活性表達(dá)的影響（空載體 pGL4.17 作為陰性對(duì)照）Figure 2 Effects of transfection agent concentrations on luciferase activity after the transiently transfection of recombinant reporter plasmid (promoterless pGL4.17 as a negative control)

2.4 篩選條件的優(yōu)化

考察了 0.01％ ～ 1％ DMSO 對(duì)熒光素酶表達(dá)活性的影響，在 0.01％ ～ 0.1％ 的濃度范圍內(nèi)，DMSO 不會(huì)對(duì) ApoP-Luc HepG2 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的熒光素酶活性表達(dá)產(chǎn)生明顯影響（圖 3A，n = 3）。故篩選時(shí)采用 DMSO 溶劑的終濃度為 0.1％。為確定化合物作用的合適時(shí)間，參閱文獻(xiàn)[7]的報(bào)道，選擇 16、18、20 和 24 h 檢測(cè)細(xì)胞熒光素酶表達(dá)活性。結(jié)果表明，從 16 ～ 20 h，ApoP-Luc HepG2 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的熒光素酶活性存在緩慢上升趨勢(shì)，20 h 后，表達(dá)趨于穩(wěn)定。因此，確定化合物作用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的時(shí)間為 20 h（圖 3B，n = 3）。

2.5 模型驗(yàn)證與評(píng)價(jià)

不同濃度的 Genistein 作用細(xì)胞模型20 h后，測(cè)定熒光素酶表達(dá)活性。結(jié)果顯示，對(duì)于 ApoP-LucHepG2 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞，在一定濃度范圍內(nèi)，熒光素酶相對(duì)活性值隨著 Genistein 濃度的增加而升高，呈濃度依賴(lài)性，EC50為 3.57 μmol/L（圖4，n = 3）。本研究中 Genistein 對(duì) Apo A-I 轉(zhuǎn)錄激活作用與文獻(xiàn)[8]報(bào)道一致，說(shuō)明 Genistein 能有效作用于已構(gòu)建的 pGL4-ApoP 表達(dá)載體，其對(duì) Apo A-I 基因的轉(zhuǎn)錄激活作用能通過(guò)熒光素酶活性得到反映，從而證明所構(gòu)建的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞用于此類(lèi)藥物篩選的可行性。選取 Genistein 作為模型的陽(yáng)性對(duì)照，對(duì)模型的可靠程度、敏感度、重現(xiàn)性和準(zhǔn)確性加以衡量，評(píng)價(jià)了多項(xiàng)高通量篩選指標(biāo)。結(jié)果表明，S/B、S/N、CV 和Z’因子分別為 5.12、30.1、6.1 和0.68，優(yōu)于進(jìn)行高通量篩選試驗(yàn)所要求的 ＞ 3、＞ 10、＜ 10 和 ≥ 0.5的標(biāo)準(zhǔn)。說(shuō)明本研究建立的模型穩(wěn)定可靠，適合應(yīng)用于高通量篩選。

圖3 模型篩選條件的優(yōu)化結(jié)果Figure 3 Results of optimization on screening model

2.6 化合物初步篩選結(jié)果

應(yīng)用該模型對(duì)本研究所的化合物庫(kù)進(jìn)行了篩選，通過(guò)檢測(cè)熒光素酶活性，發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇和毛蕊異黃酮、芹菜素、高良姜素和千層紙素 A 等黃酮類(lèi)化合物對(duì) Apo A-I 轉(zhuǎn)錄活性上調(diào)作用明顯，進(jìn)一步采用不同濃度的上述化合物作用于 ApoP-Luc HepG2 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞，證明上述化合物的轉(zhuǎn)錄激活作用均呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性，半數(shù)有效濃度分別為0.49、9.40、4.81、8.49 和 7.45 μg/ml（圖5）。

圖4 染料木素對(duì)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型的量效曲線Figure 4 Effects of Genistein on lucifearase activity in stable transfected cell model

圖5 活性化合物對(duì) ApoP-Luc HepG2 細(xì)胞熒光素酶活性影響（每濃度設(shè) 4 個(gè)復(fù)孔，結(jié)果以平均值表示）Figure 5 Effects of active compounds on luciferase activity in ApoP-Luc HepG2 cells (Each sample was quadruplicated and quantitative data are expressed as mean)

3 討論

心血管疾病是全球范圍造成死亡的首要原因，動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）以富含脂肪的斑塊在大動(dòng)脈壁聚積為主要特征，是心血管病的主要病理基礎(chǔ)。20 世紀(jì) 80 年代以來(lái)，以他汀類(lèi)為代表的藥物（HMG-CoA 還原酶抑制劑）在治療動(dòng)脈粥樣硬化領(lǐng)域取得了重大進(jìn)展，主要通過(guò)減少低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）水平來(lái)干預(yù)血脂水平、減少心血管事件發(fā)生。盡管他汀類(lèi)藥物能減少約 30％ 的冠狀動(dòng)脈事件[9]，但每年仍有9％ 的受治患者受到殘余心血管病變風(fēng)險(xiǎn)的困擾[10]。因此，進(jìn)一步降低動(dòng)脈粥樣硬化心血管疾病發(fā)生，有必要關(guān)注除 LDL-C 以外的相關(guān)血脂風(fēng)險(xiǎn)因素。

人 Apo A-I 蛋白主要在肝臟和小腸中表達(dá)，成熟的 Apo A-I 蛋白含有 243 個(gè)氨基酸。Apo A-I 是 HDL 顆粒中最主要的載脂蛋白，約占 HDL 中蛋白總含量的 70％，在 HDL 的形成、代謝和功能方面都具有重要作用。人 Apo A-I 基因缺失會(huì)導(dǎo)致血漿 HDL 水平低下和家族性低 α-脂蛋白血癥，容易造成早發(fā)性動(dòng)脈粥樣硬化[11-12]。采用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和體細(xì)胞基因轉(zhuǎn)移的手段證明過(guò)表達(dá) Apo A-I 基因可以增加 HDL-C 水平，減緩動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程，并在一定程度上使斑塊退化[13-14]。Apo A-Imilano是 Apo A-I 的天然突變體，其 173 位的精氨酸被半胱氨酸所取代，該基因突變的攜帶者罹患心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)很低，臨床試驗(yàn)證明輸注 Apo A-Imilano突變體和磷脂復(fù)合物，有助于動(dòng)脈粥樣斑塊的消退，推測(cè)與增強(qiáng)泡沫化巨噬細(xì)胞膽固醇外排有關(guān)[15]。這些研究提示 Apo A-I 有可能是心血管疾病調(diào)脂治療的一個(gè)重要靶點(diǎn)。

Apo A-I 的基因表達(dá)調(diào)控主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平，靠近 Apo A-I 基因轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)的位置存在類(lèi)似TATA 盒的結(jié)構(gòu)；其 5’ 上游序列 –220 ～ –110 bp區(qū)含有若干轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，受到包括視黃醇類(lèi)物質(zhì) X 受體（RXR），過(guò)氧化物酶體增殖物激活型受體 α（PPARα）和肝 X 受體（LXR）在內(nèi)的核受體的調(diào)控；5’ 側(cè)翼的高 GC 區(qū)域存在胰島素應(yīng)答核心元件（insulin response core element，IRCE），可同轉(zhuǎn)錄因子 Sp1 結(jié)合。這些轉(zhuǎn)錄因子單獨(dú)或者相互協(xié)同作用，通過(guò)影響 Apo A-I 的基因表達(dá)來(lái)應(yīng)答激素、代謝、飲食及藥物的變化和刺激。本研究采用的人 Apo A-I 基因啟動(dòng)子序列，包括了轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和若干重要的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，有望在分子機(jī)制方面進(jìn)行深入的研究。

構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞采用的是 HepG2 細(xì)胞，它保留了人類(lèi)正常肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的許多功能，含有與Apo A-I 基因表達(dá)相關(guān)的必要轉(zhuǎn)錄因子，能夠比較真實(shí)地反映 Apo A-I 在肝臟中表達(dá)的環(huán)境，更有利于我們篩選得到作用明確的 Apo A-I 基因表達(dá)上調(diào)劑。

G418 抗性篩選和熒光素酶表達(dá)活性的檢測(cè)結(jié)果顯示，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的 HepG2 細(xì)胞中含有受 Apo A-I 上游啟動(dòng)子區(qū)調(diào)控的熒光素酶重組表達(dá)質(zhì)粒，并能夠穩(wěn)定地隨細(xì)胞培養(yǎng)傳代，說(shuō)明成功得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染有 Apo A-I 啟動(dòng)子序列的細(xì)胞株。我們選擇文獻(xiàn)報(bào)道的 Genistein 檢測(cè)其對(duì) Apo A-I 轉(zhuǎn)錄活性的影響，結(jié)果表明，Genistein 能提高穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞中 Apo A-I 的轉(zhuǎn)錄活性。后續(xù)的篩選發(fā)現(xiàn)，除Genistein 之外，多個(gè)黃酮類(lèi)化合物都能以劑量依賴(lài)的方式作用于 Apo A-I 調(diào)控區(qū)，可能與這些化合物具有植物雌激素作用，能結(jié)合雌激素受體相關(guān)。另外，白藜蘆醇在本篩選模型上顯示出較好的活性，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，這類(lèi)均二苯乙烯類(lèi)衍生物能夠上調(diào)Apo A-I的表達(dá)水平[16]。目前，研究人員發(fā)現(xiàn)一種名為 RVX-208 的白藜蘆醇結(jié)構(gòu)衍生物，能夠在轉(zhuǎn)錄水平提高 Apo A-I 基因表達(dá)，已進(jìn)入了臨床 II期實(shí)驗(yàn)[17]，正在進(jìn)行藥代動(dòng)力學(xué)和安全性相關(guān)評(píng)價(jià)，有望治療因 HDL-C 水平低下而引起的心血管疾病。

本研究利用報(bào)告基因的檢測(cè)方法建立了適用于高通量篩選的人 Apo A-I 基因表達(dá)上調(diào)劑篩選模型，可以在細(xì)胞水平大規(guī)模篩選作用于 Apo A-I基因表達(dá)調(diào)控序列的小分子化合物。有關(guān)陽(yáng)性化合物對(duì) Apo A-I 基因表達(dá)的影響目前正在進(jìn)一步研究中，有可能獲得治療動(dòng)脈粥樣硬化心血管疾病的新型先導(dǎo)化合物。

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MethodsHuman genomic DNA was used as a template to amplify the promoter sequence of Apo A-I using PCR. The fragment was cloned into pGEM-T vector and characterized by sequencing. The promoter fragment was then inserted upstream of luciferase reporter gene of pGL4.17, and then transfected into HepG2 cell line using LipofectamineTM2000. Stable transfectant was obtained using limited cell dilution method in the presence of G418. Samples were detected by measuring luciferase activity of stable transfected HepG2 cells in 96-well format after assay optimization and validation with genistein.

ResultsThe promoter sequence of Apo A-I containing essential transcriptional elements was obtained from human genomic DNA by PCR. The reporter plasmid named pGL4-ApoP was constructed by inserting the promoter sequence upstream of luciferase reporter gene of pGL4.17. The drug screening model was established and evaluated using genistein as a positive control. Z’-factor is above 0.5, showing that this model was robust and reliable. About 5000 compounds were screened and resveratrol and several flavonoids were identified as positive compounds.

ConclusionThis new drug screening model could be efficiently applied to screen up-regulators of human Apo A-I gene expression.【Key Words】Apolipoprotein A-I; Transcription initiation site; Luciferases; Drug evaluation, preclinical

Author Affiliations:Department of Bioengineering (DU Yu, WANG Li, WANG Li-fei, YANG Yuan, HONG Bin), National Laboratory for Screening New Microbial Drugs (SI Shu-yi), Institute of Medicinal Biotechnology, Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing 100050, China

Establishment of a high-throughput screening model for identifying up-regulator of human Apo A-I expression

DU Yu, WANG Li, WANG Li-fei, SI Shu-yi, YANG Yuan, HONG Bin

ObjectiveTo establish a high-throughput screening model based on transcriptional regulation of human apolipoprotein A-I for identifying up-regulator of Apo A-I gene expression.

s:HONG Bin, Email: binhong69@hotmail.com; YANG Yuan, Email: yangyuan78@hotmail.com

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2011.03.003

國(guó)家自然科學(xué)基金（30801401）；“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專(zhuān)項(xiàng)“十一五”計(jì)劃（2009ZX09302-004）

100050 北京，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所衛(wèi)生部抗生素生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（杜郁、王麗、王麗非、楊媛、洪斌），國(guó)家新藥（微生物）篩選實(shí)驗(yàn)室（司書(shū)毅）

洪斌，Email：binhong69@hotmail.com；楊媛，Email：yangyuan78@hotmail.com

2011-03-16

方法以人基因組 DNA 為模板，PCR 擴(kuò)增 Apo A-I 上游的啟動(dòng)子序列，克隆至熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒 pGL4.17 上游，采用脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞HepG2，在 G418 抗性存在的條件下，通過(guò)有限稀釋法篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。對(duì)溶劑濃度和藥物作用時(shí)間進(jìn)行條件優(yōu)化，應(yīng)用陽(yáng)性化合物染料木素評(píng)價(jià)模型有效性，通過(guò)檢測(cè)熒光素酶的表達(dá)活性變化來(lái)篩選人 Apo A-I 基因表達(dá)上調(diào)劑。

結(jié)果通過(guò) PCR 成功擴(kuò)增了人 Apo A-I 基因上游的啟動(dòng)子序列，構(gòu)建了相應(yīng)的重組熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒 pGL4-ApoP，并建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株 ApoP-Luc HepG2。對(duì)篩選條件優(yōu)化后，應(yīng)用陽(yáng)性化合物進(jìn)行評(píng)價(jià)，篩選窗相關(guān)系數(shù) Z’因子為 0.68，大于 0.5，適于進(jìn)行高通量篩選。應(yīng)用該篩選模型對(duì) 5000 余種化合物進(jìn)行篩選，4 個(gè)黃酮類(lèi)化合物和白藜蘆醇顯示出較好的活性，半數(shù)有效濃度均小于 10 μg/ml。

結(jié)論成功建立了人 Apo A-I 基因表達(dá)上調(diào)劑篩選模型，并利用該模型篩選到 5 個(gè)活性化合物。

www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol, 2011, 6(3):178-183