柳文菊，楊章元，劉學(xué)政，謝良才，王嫻默

(長江大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗科，湖北 荊州 434000)

近年來肺炎支原體(Mycoplasma pneumaniae，MP)所致小兒呼吸道感染呈逐年上升趨勢[1]，臨床表現(xiàn)也多種多樣，不易與其他病原微生物感染相鑒別，因此肺炎支原體感染的實驗室診斷就顯得尤為重要。用于檢測MP感染的實驗室診斷方法有MP培養(yǎng)分離、冷凝集試驗、MP特異性抗體檢測及PCR法等。我們對515例呼吸道感染的患兒樣本分別用不同的方法檢測并進(jìn)行比較，以了解不同檢測方法對臨床診斷的意義，從而為臨床醫(yī)生的診療提供可靠和有效的快速檢測手段。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來源 2010年9月至2011年5月我院兒科門診及住院部呼吸道感染的患兒515例，男289例，女226例，年齡1個月～13歲。另有非呼吸道感染者100例為對照組，兩組性別、年齡差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。

1.2 試劑 被動顆粒凝集法采用日本富士瑞必歐株式會社生產(chǎn)的賽樂迪亞-麥克Ⅱ(SERODIA-MYCOⅡ)試劑盒；酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA法)由EUROIMMUN醫(yī)學(xué)實驗診斷股份公司提供的試劑盒；金標(biāo)滲濾法試劑盒購自蘭波生物技術(shù)研究所；PCR采用上海復(fù)星醫(yī)學(xué)科技發(fā)展有限公司提供的試劑盒；培養(yǎng)法用上海奧普生物醫(yī)藥公司MP專用液體培養(yǎng)基。

1.3 實驗方法

1.3.1 冷凝集實驗(CAT)血清標(biāo)本《按中華醫(yī)學(xué)檢驗全書》“冷凝集測定”進(jìn)行操作，滴度≥1：64為陽性。

1.3.2 被動顆粒凝集法 血清標(biāo)本嚴(yán)格按試劑說明書進(jìn)行操作，當(dāng)樣品與致敏粒子的反應(yīng)圖像判定為(+)或(++)(最終稀釋倍數(shù)≥1：40)，則結(jié)果判定為陽性。

1.3.3 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA法)血清標(biāo)本嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行溫育、清洗、終止、比色。結(jié)果判定以患者與標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值的比值≥1.0為陽性。

1.3.4 PCR法 樣本處理：咽拭子標(biāo)本加入l ml無菌生理鹽水，充分振蕩搖勻漂洗，移入1.5 ml無菌離心管中，13 000 r/min離心10 min，吸取上清液棄去，留取沉淀備用。DNA提取：上述經(jīng)處理的沉淀標(biāo)本加入50 μl DNA專用提取液，高速震蕩混勻10 s，100℃保溫10 min，13 000 r/min。離心10 min備用。熒光PCR定性檢測：取4μl DNA提取液，加入26 μl MP-DNA檢測體系中在德國產(chǎn)MX3000P儀器中進(jìn)行檢測，50℃預(yù)反應(yīng)2 min；94℃預(yù)變性5 min；94℃10 s，60℃40 s，40個循環(huán)；陰陽性對照標(biāo)本同時進(jìn)行檢測。結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：將結(jié)果定義為標(biāo)本MP-DNA Ct值＜38為陽性。

1.3.5 培養(yǎng)法 在患者入院未用藥之前(且近3 d內(nèi)未用過大環(huán)內(nèi)酯類抗菌素治療)，取咽拭子培養(yǎng)，嚴(yán)格無菌操作。結(jié)果判定：培養(yǎng)液由黃轉(zhuǎn)紅為陽性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)分析采用SPSS14.0統(tǒng)計軟件包處理。分析數(shù)據(jù)采用χ2檢驗。

2 結(jié)果

2.1 呼吸道感染患兒與非呼吸道感染者檢測MP結(jié)果 分別對臨床診斷為呼吸道感染的患兒與對照組非呼吸道感染的患兒進(jìn)行MP抗體的檢測，515例呼吸道感染組中，陽性111例，陽性率為21.6%；100例非呼吸道感染對照組，陽性6例，陽性率為6.0%，兩組陽性率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

2.2 不同實驗方法對呼吸道感染患兒MP的檢出結(jié)果 515例呼吸道感染患兒樣本，用培養(yǎng)法檢測陽性35例，陽性率為6.8%；用被動顆粒凝集法檢測陽性102例，陽性率為19.8%；ELISA法檢測陽性95例，陽性率為18.4%；運用冷凝集試驗檢測陽性40例，陽性率為7.8%；PCR法檢測陽性108例，陽性率為21.0%。PCR法與被動顆粒凝集法、ELISA法比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)；PCR法與培養(yǎng)法、冷凝集試驗比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

3 討論

肺炎支原體屬于柔膜體綱，是一種介于病毒和細(xì)菌之間已知最小的非活性生長致病微生物[2]，無細(xì)胞壁，最外層為細(xì)胞膜，基本形態(tài)呈球形或絲形，長2～5 μm，革蘭氏染色陰性[3]。人是MP的唯一宿主[4]，兒童和青年多被感染(約40%在5歲以下)[5]。除了原發(fā)性非典型性肺炎和常見的呼吸器官感染癥狀，MP還可以導(dǎo)致一些其他的疾病癥狀，給患兒健康帶來極大的損害。因此實驗室診斷顯得很有價值。

本次研究結(jié)果表明肺炎支原體抗體陽性率在呼吸道感染患兒中有較高的比例，占總病例的21.6%。因此，對呼吸道感染的患兒進(jìn)行MP的檢測是非常必要的。對臨床及早找到致病源并確定治療方案及用藥都是很有意義的。培養(yǎng)分離和鑒別MP對診斷和鑒別有決定性意義，是MP鑒定的金標(biāo)準(zhǔn)，但該法要求高，需時長(2～3周)，且檢出率較低，在臨床上推廣應(yīng)用有困難[6]。

SERODIA-MYCOⅡ凝集試驗方法檢查肺炎支原體操作簡便，敏感性高，能夠滿足肺炎支原體篩查需要。但該試劑試驗僅用于檢測肺炎支原體抗體，而非直接檢測肺炎支原體。因此陽性結(jié)果并不能確診是MP感染。另外，我們發(fā)現(xiàn)有些MP感染的患者，不產(chǎn)生抗體或只產(chǎn)生少量抗體，該方法有時也是不能檢測到的，分析可能與個體免疫力差異有關(guān)，這就有個假陰性的問題。CAT為臨床常用的MP感染輔助診斷指標(biāo)，但患者病程要達(dá)到一周以上才會有陽性結(jié)果。而且與其他感染也有一定的交叉反應(yīng)，缺乏特異性，漏診率也較高，不能早期、快速診斷，影響及時治療[7]。

ELISA法檢測的MP-IgM在感染一周后產(chǎn)生，3～4周其效價達(dá)高峰，但如果是輕度感染僅能刺激局部免疫而不能被檢測，另有部分治愈后患者仍有一定強度的抗體滴度，這就不能解決一些假陽性和假陰性問題，從而影響對患者的正確合理的診療。PCR法直接檢測患者感染的肺炎支原體，能快速反映患者的實時感染情況。且敏感性、特異性都較高，沒有交叉反應(yīng)[8]，用時也不長，一般3 h左右可出結(jié)果。同時做好陰陽對照，讓檢驗標(biāo)準(zhǔn)化，給臨床提供及時可信的結(jié)果。但PCR法也存在對設(shè)備和人員要求較高、費用較高的問題。

此次研究結(jié)果還表明PCR法檢測患兒咽拭子樣本與血清學(xué)被動顆粒凝集法、ELISA法都有較高的陽性率，分別為21.0%、19.8%、18.4%，且它們之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。因此，臨床醫(yī)生可根據(jù)患兒病情及自身的具體情況靈活選擇合適的檢測手段，讓患兒得到及時明確的診斷，縮短診療病程。另從結(jié)果中我們還能看出，PCR法、被動顆粒凝集法以及ELISA法對患兒的檢出率明顯優(yōu)于培養(yǎng)法及冷凝集試驗(P＜0.05)，盡管培養(yǎng)法在MP的確診上是金標(biāo)準(zhǔn)，但低檢出率和耗時長嚴(yán)重地制約了它的發(fā)展。同樣冷凝集試驗的高漏診率也給臨床造成了困擾。

綜上所述，要想呼吸道感染患兒能夠得到MP的早期診斷，PCR法是個不錯的選擇。特別是針對年齡較小者，咽拭子的取樣簡便無創(chuàng)傷，更易被患者接受，為臨床制定治療方案及選擇藥物提供重要參考。而一周后如果能結(jié)合血清學(xué)檢測中的被動顆粒凝集試驗，特別是雙份血清檢測的提出，對一定程度上提高了MP感染檢測的敏感性和特異性，以及明確感染所處時期有非常重要的臨床應(yīng)用價值。

[1]楊曉梅.小兒支原體肺炎肺外表現(xiàn)82例臨床分析[J].海南醫(yī)學(xué)，2008,19(5)：87-88.

[2]李儉慶,黃秀麗,賈金榮.阿奇霉素聯(lián)合紅霉素治療小兒支原體肺炎40例臨床觀察[J].海南醫(yī)學(xué),2009,20(8)：60-61.

[3]馮仁豐.實用醫(yī)學(xué)檢驗學(xué)[M].上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社,1996：752-754.

[4]Halbedel S,Stulke J.Tools for the genetic analysis of Mycoplasma[J].Int J Med Microbiol,297(2007)：37-44.

[5]Eun BW,Kim NH,Choi EH,et al.Mycoplasma pneumoniae in Korean children：the epidemiology of pneumonia over an 18-year period[J].J Infect,56(5)：326-331.

[6]Yamazaki T,Narita M,Sasaki N,et al.Comparison of PCR for sputum samples obtained by induced cough and serological tests for diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infection in children[J].Clin Vaccine Immunol,2006,13(6)：708-710.

[7]高鵬翔.小兒支原體肺炎的早期診斷[J].中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用,2009,3(2)：86-87.

[8]孔 梅,周樂全,鐘芳華.PCR法檢測肺炎支原體的臨床應(yīng)用及結(jié)果分析[J].中國實用醫(yī)藥,2009,4(36)：21-22.