孫鳳娥 王蕾 周慧敏

近年來，糖尿病患者惡性腫瘤發(fā)生率明顯增加。大量研究顯示，糖尿病與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［1］。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)在抑制腫瘤免疫、促進腫瘤血管形成中發(fā)揮重要作用，對惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展及預后具有重要意義［2］。目前有關(guān)葡萄糖和胰島素對4T1腫瘤細胞分泌VEGF的影響，筆者尚未見相關(guān)研究報道。本實驗體外檢測不同濃度的葡萄糖和胰島素對4T1腫瘤細胞VEGF分泌的影響，為分析糖尿病與乳腺癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系提供實驗和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗用腫瘤細胞株為小鼠乳腺癌細胞株(4T1腫瘤細胞，河北醫(yī)科大學免疫學教研室凍存);RPMI 1640細胞培養(yǎng)基為?？寺∩镏破酚邢薰井a(chǎn)品;胎牛血清為ExCell Biology，Inc.產(chǎn)品;胰島素為江蘇萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司產(chǎn)品;葡萄糖、青霉素、鏈霉素均為華北制藥有限公司產(chǎn)品;小鼠VEGF酶聯(lián)免疫試劑盒為美國R＆D公司產(chǎn)品。

1.2 4T1腫瘤細胞的培養(yǎng) 4T1腫瘤細胞復蘇后，接種于RPMI 1640培養(yǎng)基(其中含10%的胎牛血清，100 U/ml的青霉素，100 μg/ml的鏈霉素)中，置于 37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，約24～48 h換液1次，當細胞生長至90%以上時進行傳代。

1.3 實驗分組 取對數(shù)生長期的4T1腫瘤細胞進行分組實驗。根據(jù)培養(yǎng)液加入葡萄糖和胰島素濃度的不同，將實驗所用細胞分為15組:A組(對照組)只加RPMI 1640培養(yǎng)液(不含葡萄糖和胰島素);B組RPMI 1640培養(yǎng)液+5mmol/L葡萄糖;C組RPMI 1640培養(yǎng)液+10 mmol/L葡萄糖;D組RPMI 1640培養(yǎng)液+25 mmol/L葡萄糖;E組RPMI 1640培養(yǎng)液+35 mmol/L葡萄糖;F組RPMI 1640培養(yǎng)液+5μU/ml胰島素;G組RPMI 1640培養(yǎng)液 +25μU/ml胰島素;H組 RPMI 1640培養(yǎng)液 +125 μU/ml胰島素;I組 RPMI 1640 培養(yǎng)液 +250 μU/ml胰島素;J組RPMI 1640培養(yǎng)液 +1.25 μU/ml胰島素;K 組 RPMI 1640培養(yǎng)液+5 mmol/L葡萄糖+5 μU/ml胰島素;L組RPMI 1640培養(yǎng)液+5 mmol/L葡萄糖+125 μU/ml胰島素;M組RPMI 1640培養(yǎng)液+25 mmol/L葡萄糖+125 μU/ml胰島素;N組RPMI 1640培養(yǎng)液+25 mmol/L葡萄糖+5 μU/ml胰島素;O組RPMI 1640培養(yǎng)液 +25 mmol/L葡萄糖 +1.25 μU/ml胰島素。

1.4 實驗各組4T1細胞培養(yǎng)上清的制備 將對數(shù)生長期的4T1細胞接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，濃度為2×105/ml，15個實驗組每組均設(shè)雙復孔，每孔培養(yǎng)液均為3 ml，置于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。48 h后收集細胞培養(yǎng)上清，離心3000 r/min 20 min，－20℃保存。

1.5 ELISA法檢測4T1細胞培養(yǎng)上清中VEGF的含量 采用雙抗體夾心法。嚴格按小鼠VEGF定量檢測試劑盒(ELISA)說明書操作。通過繪制標準曲線，計算樣品中VEGF的濃度。

1.6 統(tǒng)計學分析應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，計量資料以表示，進行單因素方差分析和t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度的葡萄糖對4T1細胞分泌VEGF的影響 含有不同濃度葡萄糖的B、C、D、E組細胞培養(yǎng)上清中VEGF的濃度［分別為(123±13)pg/ml、(127 ±12)pg/ml、(129 ±13)pg/ml、(125±10)pg/ml］與 A組［(115±7)pg/ml］比較差異均無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05)。

2.2 不同濃度的胰島素對4T1細胞分泌VEGF的影響 F組、G組和J組細胞培養(yǎng)上清中VEGF的濃度［分別為(125±12)pg/ml、(130 ±10)pg/ml］和［(128 ±11)pg/ml］與 A 組比較均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);但是隨著胰島素濃度的變化，含有高濃度胰島素的 H組、I組(培養(yǎng)液分別含有125 μU/ml、250 μU/ml的胰島素)細胞培養(yǎng)上清中VEGF的濃度［分別為(151±9)pg/ml、(153±11)pg/ml］與 A組比較均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，但H組和I組之間比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

2.3 不同濃度的葡萄糖和胰島素同時作用對4T1細胞分泌VEGF的影響 L組和M組細胞培養(yǎng)上清中VEGF的濃度［分別為(151±11)pg/ml和(150±14)pg/ml］與A組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);而K組、N組和O組細胞培養(yǎng)上清中VEGF的濃度［分別為(126±14)pg/ml、(130±17)pg/ml和(130±15)pg/ml］與A組比較差異無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05)。

3 討論

在2型糖尿病病程中，經(jīng)常存在不同程度的胰島素抵抗和高胰島素血癥。以往的研究顯示，胰島素在高濃度時能引起兔視網(wǎng)膜Muller細胞VEGF分泌增加及其mRNA表達增加［3］;對糖尿病大鼠進行胰島素治療，發(fā)現(xiàn)胰島素可導致VEGF mRNA表達量和VEGF含量增加［4］;而應(yīng)用胰島素治療糖尿病患者也有類似發(fā)現(xiàn)［5］。有學者應(yīng)用胰島素作用于結(jié)直腸癌腫瘤細胞，顯示胰島素能促進腫瘤細胞分泌VEGF［6］。本實驗結(jié)果與以往這些研究結(jié)果相似。國外學者通過對胰腺癌的研究提出，高濃度胰島素上調(diào)腫瘤細胞VEGF mRNA的表達、增加VEGF分泌的機制是通過結(jié)合IGF-I受體所致［7］。胰島素和IGF-1與彼此受體間存在交叉結(jié)合現(xiàn)象［8］，胰島素在高濃度時既能與胰島素受體結(jié)合，也能與IGF-I受體結(jié)合。

VEGF可由某些腫瘤細胞、腫瘤間質(zhì)細胞和單核巨噬細胞產(chǎn)生。一方面，VEGF可直接刺激血管內(nèi)皮細胞增殖，形成新生血管［9］，有利于腫瘤的生長、浸潤和轉(zhuǎn)移;另一方面，VEGF可通過發(fā)揮免疫抑制作用，促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展:(1)抑制樹突狀細胞(DC)的分化、成熟及抗原提呈功能［10］;(2)抑制細胞毒T細胞(CTL)特異性殺傷靶細胞的功能;(3)抑制凋亡因子的表達，阻止腫瘤細胞凋亡［11］。

有資料顯示，乳腺癌組織中VEGF的表達水平與腫瘤組織的微血管密度呈正相關(guān)，與乳腺癌轉(zhuǎn)移、復發(fā)、生存率明顯相關(guān)［12］，表明VEGF對乳腺癌的發(fā)生發(fā)展及預后具有重要作用。因此，對于糖尿病患者以及糖尿病伴有乳腺癌的患者，應(yīng)控制胰島素抵抗和高胰島素血癥，減少VEGF的分泌，以阻止乳腺癌的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移。

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11 Beierle EA，Strande LF，Chen MK.VEGF upregulates Bcl-2 expression and is associated with decreased apoptosis in neuroblastoma cells.J Pediatr Surg，2002，37:467-471.

12 李宏江，敬靜，汪靜，等.乳腺癌血管內(nèi)皮生長因子與微血管密度的分布及與預后的關(guān)系.腫瘤學雜志，2002，8:215-217.