楊一林，周 敏,*，施春雷，楊捷琳，史賢明

(1.上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海 200240；2.上海市出入境檢驗(yàn)檢疫局，上海 200135)

食品中熒光假單胞菌聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)體系的建立和評(píng)價(jià)

楊一林1，周 敏1,*，施春雷1，楊捷琳2，史賢明1

(1.上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海 200240；2.上海市出入境檢驗(yàn)檢疫局，上海 200135)

建立用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)檢測(cè)食品中熒光假單胞菌的方法。分別針對(duì)16～23S rRNA基因間隔區(qū)序列、gyrB基因以及通過(guò)生物信息學(xué)方法發(fā)掘到的4個(gè)種特異性基因設(shè)計(jì)6對(duì)檢測(cè)引物，通過(guò)初步特異性實(shí)驗(yàn)，篩選出一對(duì)種特異性最佳的引物。最終建立以gyrB基因?yàn)闄z測(cè)靶點(diǎn)的PCR擴(kuò)增體系，并對(duì)體系進(jìn)行系統(tǒng)評(píng)價(jià)。結(jié)果表明：該方法可特異檢測(cè)熒光假單胞菌的存在，純DNA檢測(cè)靈敏度為14.9fg/μL (2～3拷貝/μL)，純培養(yǎng)物檢測(cè)靈敏度為2.8×102CFU/mL。豆奶樣品經(jīng)15h充分增菌可提高檢測(cè)靈敏度至0.28CFU/25g。

熒光假單胞菌；gyrB基因；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)；檢測(cè)；食品

熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)是屬于假單胞菌屬的嗜冷微生物，為革蘭氏陰性，能產(chǎn)生水溶性的黃綠色熒光色素[1]。熒光假單胞菌廣泛存在于水和土壤當(dāng)中，在冷藏的高蛋白、高脂肪食品(生肉、生牛奶等)中，它是導(dǎo)致食品腐敗的優(yōu)勢(shì)菌群[2-3]。臨床上，該菌主要感染先天性和獲得性免疫缺陷的人群，進(jìn)入患者血液會(huì)導(dǎo)致敗血癥、感染性休克和血管內(nèi)凝血等嚴(yán)重后果，是典型的“條件致病菌”[4-6]。隨著冰箱的普及，食品中此類菌誘發(fā)食物中毒、危害人體健康的可能性日趨增大[7-8]。

目前，國(guó)內(nèi)對(duì)熒光假單胞菌的檢測(cè)鑒定依然以傳統(tǒng)培養(yǎng)方法為標(biāo)準(zhǔn)，該方法檢驗(yàn)過(guò)程耗時(shí)、繁瑣，不能滿足快速高通量監(jiān)測(cè)食品樣品的要求。而基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)的檢測(cè)方法靈敏、特異、快速，已被廣泛應(yīng)用于食源性致病菌的檢測(cè)。檢測(cè)靶點(diǎn)是分子檢測(cè)方法的關(guān)鍵，隨著生物信息學(xué)技術(shù)的發(fā)展，3株熒光假單胞菌(pf 0-1、pf-5、pf SBW25)的基因組完成測(cè)序，為檢測(cè)靶點(diǎn)的選擇和特異引物的設(shè)計(jì)提供了足夠的依據(jù)，通過(guò)多重序列BLAST比對(duì)可快速發(fā)掘新的特異檢測(cè)位點(diǎn)。

熒光假單胞菌的PCR檢測(cè)還處于起步階段，2004年Scarpellini等[9]針對(duì)16S rRNA 基因設(shè)計(jì)了引物16SPSEfluF/R，目前常被應(yīng)用于檢測(cè)和鑒定熒光假單胞菌。2009年，Irenehanning等[10]利用gyrB基因的特異性，將熒光假單胞菌和莓實(shí)假單胞菌這兩種細(xì)菌和其他假單胞菌分開，但沒(méi)有對(duì)這對(duì)引物做系統(tǒng)評(píng)價(jià)。2010年，鄧顯文等[11]依據(jù)16～23S rRNA基因間隔區(qū)序列建立PCR檢測(cè)體系，診斷羅非魚的熒光假單胞菌病，但僅對(duì)4株熒光假單胞菌分離株進(jìn)行了驗(yàn)證。本研究將通過(guò)生物信息學(xué)手段，尋找新的種特異性的檢測(cè)靶點(diǎn)，針對(duì)這些靶點(diǎn)以及16～23S rRNA基因間隔區(qū)序列與gyrB基因設(shè)計(jì)和篩選出新的種特異性強(qiáng)的引物，建立和優(yōu)化熒光假單胞菌PCR檢測(cè)體系，并對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)評(píng)價(jià)，旨在形成一套快速、準(zhǔn)確、安全的熒光假單胞菌檢測(cè)方法，為食品安全監(jiān)測(cè)提供技術(shù)支撐和有力的保障。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 細(xì)菌菌株

實(shí)驗(yàn)所用菌株名稱和來(lái)源見表1。實(shí)驗(yàn)菌株均為-80℃甘油管保存。

表1 菌株及PCR檢測(cè)結(jié)果Table 1 Strains used in the study to characterize PCR specificity

續(xù)表1

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑

非選擇性培養(yǎng)基：營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(NB培養(yǎng)基)；營(yíng)養(yǎng)肉湯瓊脂培養(yǎng)基(NA培養(yǎng)基)。

選擇性培養(yǎng)基：假單胞菌瓊脂培養(yǎng)基(英國(guó)Oxoid公司)；選擇性增菌液[12]。

實(shí)驗(yàn)所用種特異性引物序列g(shù)yrBF/R、ITSF/R(表2)由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成；測(cè)序工作委托北京六合華大基因有限公司完成。

Taq酶等PCR反應(yīng)試劑 深圳富酶泰斯生物技術(shù)有限公司；100bp DNA Marker 北京天根生化科技有限公司；DNA凝膠回收試劑盒 上海星漢生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PTC-200 PCR儀 美國(guó)Bio-Rad公司；GIS 2020系列數(shù)碼凝膠圖像處理系統(tǒng) 上海天能科技有限公司；HZ-8211K恒溫振蕩器 太倉(cāng)市科教器材廠；EPS 301電泳儀美國(guó)Amersham Biosiences公司；Thermomixer comfort恒溫混勻器、5415D高速離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；ES-315高壓蒸汽滅菌器 日本Tomy公司；CA-1480-2垂直層流潔凈工作臺(tái) 上海上凈凈化設(shè)備有限公司；DHP-9162恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司；DU800紫外核酸蛋白分析儀 美國(guó)Beckman Coulter公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)所用熒光假單胞菌于28℃條件下培養(yǎng)，非熒光假單胞菌于37℃條件培養(yǎng)。

1.3.2 基因組DNA的提取

在不同的實(shí)驗(yàn)中分別采取苯酚-氯仿-異戊醇法或煮沸法提取核酸DNA[13]。

1.3.3 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)熒光假單胞菌pf SBW 25的基因組測(cè)序結(jié)果，通過(guò)本實(shí)驗(yàn)室建立的軟件平臺(tái)[14]，將其所有CDS序列與其他常見食源性致病菌全基因組進(jìn)行BLAST比對(duì)，得到237個(gè)種特異性的基因(E值＞0.1)，再經(jīng)手動(dòng)在線BLAST比對(duì)，發(fā)掘得到4個(gè)熒光假單胞菌種內(nèi)保守的基因(同源性＞70%)。這4個(gè)基因分別編碼AraC家族轉(zhuǎn)錄調(diào)控子和不同的假性蛋白。采用primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，經(jīng)過(guò)primer-BLAST比對(duì)，篩選出理論上可以特異擴(kuò)增熒光假單胞菌的引物對(duì)。

另外，熒光假單胞菌不同菌株的16～23S rDNA序列區(qū)間和gyrB基因DNA序列分別具有較高同源性，且具有種特異性。在GeneBank中查找到熒光假單胞菌不同菌株的上述基因序列，經(jīng)CLUSTALX 1.8.1比對(duì)分析，找到種間特異種內(nèi)保守區(qū)段設(shè)計(jì)引物并進(jìn)行理論篩選。

使用設(shè)計(jì)出的引物對(duì)假單胞菌屬的菌株(表1)進(jìn)行PCR反應(yīng)驗(yàn)證，最終篩選出特異性好的引物gyrBF/R進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。引物信息如表2所示。本研究將引物16SPSEfluF/R作為對(duì)照，考察新體系的相對(duì)優(yōu)勢(shì)。

1.3.4 PCR反應(yīng)體系建立

PCR體系和反應(yīng)程序如2.2節(jié)所述，其中Mg2+添加量和退火溫度經(jīng)優(yōu)化之后確定。PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠(1.5%)電泳(160V、30min)，溴化乙錠染色10min，用GIS凝膠成像系統(tǒng)觀察分析電泳結(jié)果。

1.3.4.1 Mg2+濃度優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

設(shè)置一系列的Mg2+濃度梯度，使每個(gè)反應(yīng)體系中的Mg2+濃度分別為1.25、1.875、2.5、3.125μmol/L。分別在這4個(gè)梯度上進(jìn)行PCR擴(kuò)增(以熒光假單胞菌CICC21896基因組DNA為模板)，根據(jù)電泳結(jié)果的條帶亮度和寬度以及有否非特異性擴(kuò)增，確定最佳的Mg2+濃度。

1.3.4.2 退火溫度優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

參考引物設(shè)計(jì)軟件的推薦Tm值(56.6℃)，在Tm±5℃范圍內(nèi)設(shè)置12個(gè)溫度梯度(52～62℃)，以熒光假單胞菌CICC21896基因組DNA為模板分別進(jìn)行擴(kuò)增，根據(jù)電泳結(jié)果的條帶亮度和寬度以及有否非特異性擴(kuò)增，確定擴(kuò)增退火溫度。

表2 引物序列信息Table 2 Information about the primers used in this study

1.3.5 PCR檢測(cè)體系評(píng)價(jià)

1.3.5.1 特異性評(píng)價(jià)

對(duì)表1中所列出的菌株分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以滅菌蒸餾水為空白對(duì)照。如電泳結(jié)果在271bp處出現(xiàn)條帶，則為陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果。將陽(yáng)性條帶割膠回收，進(jìn)行測(cè)序，并對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BLAST比對(duì)，確定擴(kuò)增產(chǎn)物序列是否與設(shè)計(jì)目的片斷一致。

1.3.5.2 靈敏度評(píng)價(jià)

純DNA水平靈敏度評(píng)價(jià)：提取熒光假單胞菌AS1.55基因組DNA，使用含100μg/mL RNaseA的無(wú)菌水處理，測(cè)定核酸濃度。10倍梯度稀釋至10-10水平，對(duì)每個(gè)濃度梯度分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以滅菌蒸餾水為空白對(duì)照，檢測(cè)引物靈敏度。

純培養(yǎng)物水平靈敏度評(píng)價(jià)：將培養(yǎng)12h的熒光假單胞菌AS1.55菌液，進(jìn)行10倍梯度稀釋至10-10水平，選取10-6、10-7、10-8三個(gè)稀釋倍數(shù)梯度進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，同時(shí)對(duì)每個(gè)梯度水平的菌液采取煮沸法提取基因組DNA，分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以滅菌蒸餾水為空白對(duì)照，檢測(cè)引物靈敏度。

1.3.5.3 抗干擾能力評(píng)價(jià)

選取惡臭假單胞菌(ATCC17485)、銅綠假單胞菌(IQCC12625)、產(chǎn)堿假單胞菌(IQCC12604)和洋蔥假單胞菌(CICC21624)4株干擾菌，與熒光假單胞菌(AS1.55)分別培養(yǎng)至穩(wěn)定期，10倍梯度稀釋，分別計(jì)數(shù)，將4種干擾菌混合，設(shè)置3個(gè)干擾濃度(N×104、N×106、N× 108)，與熒光假單胞菌不同梯度稀釋液分別混合搖瓶培養(yǎng)(28℃、150r/min)，于0h和15h(依據(jù)人工污染的結(jié)果選取)分別取樣1次，煮沸法提取基因組DNA，分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以不加入熒光假單胞菌的干擾菌混合液為空白對(duì)照，檢測(cè)抗干擾能力(圖1)。

圖1 抗干擾實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)圖示Fig.1 Experimental scheme to test the presence of background bacteria

1.3.6 人工污染食品樣品實(shí)驗(yàn)

將活化的熒光假單胞菌(AS1.55)菌液接入NB培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)至穩(wěn)定期，10倍梯度稀釋，平板計(jì)數(shù)。向225mL選擇性增菌液中接入25mL豆奶，分別接入1～10、10～100、100～1000CFU/mL三個(gè)梯度的菌液，平行3次，于0、3、6、9、1 2、1 5、2 4 h各取樣一次，煮沸法提取基因組DNA，分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以滅菌蒸餾水為空白對(duì)照。所選食品樣品經(jīng)培養(yǎng)法[12]證實(shí)不含有檢測(cè)目的菌。

2 結(jié)果與分析

2.1 靶點(diǎn)篩選和引物設(shè)計(jì)

使用軟件設(shè)計(jì)的6對(duì)引物(表2)對(duì)假單胞菌屬的21株菌株分別進(jìn)行擴(kuò)增，初步驗(yàn)證其特異性。結(jié)果表明引物Hp2F/R出現(xiàn)了假陽(yáng)性現(xiàn)象，引物ITSF/R、AraCF/R、Hp3F/R、Hp4F/R則出現(xiàn)了假陰性現(xiàn)象，這是由于各雖同源性較高，但序列中散布著大量突變位點(diǎn)而造成的。故選擇特異性最好的引物gyrBF/R進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 PCR反應(yīng)體系建立

圖2 gyrBF/R引物退火溫度優(yōu)化和Mg2+濃度優(yōu)化電泳圖Fig.2 Optimization of annealing temperature and Mg2+concentration for PCR using primer gyrBF/R

使用上述方法分別對(duì)PCR體系中Mg2+濃度和退火溫度進(jìn)行優(yōu)化。從圖2可以看出，當(dāng)退火溫度為59.9℃和60.8℃時(shí)，擴(kuò)增條帶最清晰明亮，后續(xù)實(shí)驗(yàn)在此范圍內(nèi)選取60℃退火；同樣根據(jù)條帶亮度和寬度，選擇Mg2+濃度為1.875μmol/L。

優(yōu)化后P C R體系：上下游引物(10μmol/L)各0.5μL，DNA模板1～10ng，10×buffer 2μL，Mg2+(25mmol/L)1.5μL，dNTP(2.5mmol/L)1μL，Taq酶1μL，ddH2O補(bǔ)足至20μL。

優(yōu)化后PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性2 min；94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，36個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。

2.3 PCR檢測(cè)體系評(píng)價(jià)

2.3.1 特異性評(píng)價(jià)

采用優(yōu)化后擴(kuò)增體系，利用引物gyrBF/R對(duì)11株熒光假單胞菌、10株假單胞菌屬其他種類細(xì)菌、18株其他屬常見食源性致病菌分別進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果以熒光假單胞菌的基因組DNA為模板，均能擴(kuò)增出長(zhǎng)度為271bp的特異性條帶，而以非熒光假單胞菌基因組DNA為模板則沒(méi)有擴(kuò)增出特異性條帶(表1)。將擴(kuò)增條帶割膠回收，送交深圳華大基因科技有限公司測(cè)序。對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BLAST比對(duì)，證實(shí)擴(kuò)增條帶與設(shè)計(jì)目的片斷一致。

引物gyrBF/R具有穩(wěn)定的種特異性，可準(zhǔn)確區(qū)分熒光假單胞菌與非熒光假單胞菌，且特異性檢測(cè)結(jié)果與引物16SPSEfluF/R一致。

2.3.2 靈敏度評(píng)價(jià)

2.3.2.1 純DNA水平靈敏度評(píng)價(jià)

提取熒光假單胞菌AS1.55基因組DNA，使用RNA酶水純化，并用DU800測(cè)得質(zhì)量濃度為5.96ng/μL，10倍梯度稀釋至10-10水平，以滅菌蒸餾水為空白對(duì)照，分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)引物靈敏度。如圖2所示，當(dāng)每個(gè)體系中模板終濃度為1.49fg/μL時(shí)，無(wú)法檢測(cè)到目的條帶。因此最終計(jì)算得檢測(cè)靈敏度為14.9fg/μL (2～3拷貝/μL)。另外，對(duì)引物16SPSEfluF/R的評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，兩引物純D N A水平靈敏度相同。

2.3.2.2 純培養(yǎng)物水平靈敏度評(píng)價(jià)

將培養(yǎng)12h的熒光假單胞菌AS1.55菌液進(jìn)行10倍梯度稀釋至10-10水平，并對(duì)其中10-6、10-7、10-8三個(gè)梯度進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算初始菌濃度為1.1×109。同時(shí)對(duì)每個(gè)濃度的菌液采取煮沸法提取基因組DNA，以滅菌蒸餾水為空白對(duì)照，分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增。如圖3所示，當(dāng)每個(gè)體系中模板終濃度為2.8×102CFU/mL時(shí)，無(wú)法檢測(cè)到目的條帶。因此最終計(jì)算得檢測(cè)靈敏度為2.8× 102CFU/mL。

圖3 引物gyrBF/R (a)與引物16SPSEfluF/R (b)的PCR 檢測(cè)純DNA靈敏度檢測(cè)電泳圖Fig.3 Detection sensitivity of PCR using primer gyrBF/R and primer 16SPSEfluF/R to pure DNA

圖4 gyrBF/R引物PCR檢測(cè)純培養(yǎng)物靈敏度試驗(yàn)電泳圖Fig.4 Detection sensitivity of PCR using primer gyrBF/R to pure Pseudomonas fluorescens culture

2.3.3 抗干擾能力評(píng)價(jià)

選取惡臭假單胞菌(ATCC17485)、銅綠假單胞菌(IQCC12625)、產(chǎn)堿假單胞菌(IQCC12604)和洋蔥假單胞菌(CICC21624)與熒光假單胞菌(AS1.55)分別培養(yǎng)至穩(wěn)定期，10倍梯度稀釋，分別計(jì)數(shù)，計(jì)算得熒光假單胞菌和4種干擾菌純培養(yǎng)物的起始菌液濃度分別為1.1×109、6.8×108、3.4×109、4.8×109、6.8×108CFU/mL。再按1.3.5.3節(jié)所述方法進(jìn)行純培養(yǎng)物的靈敏度實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表3所示。

表3 干擾菌的存在對(duì)純培養(yǎng)物PCR檢測(cè)靈敏度的影響Table 3 Effect of background interference on detection sensitivity of Pseudomonas fluorescens in pure culture

添加約為104CFU/mL的干擾菌純培養(yǎng)物對(duì)上述PCR檢測(cè)體系的靈敏度幾乎沒(méi)有影響，而添加約為108CFU/ mL的干擾菌純培養(yǎng)物時(shí)，經(jīng)過(guò)充分的增菌培養(yǎng)也能準(zhǔn)確的檢測(cè)出熒光假單胞菌。

可見，增菌培養(yǎng)不僅可以提高檢測(cè)靈敏度，還可以提高檢測(cè)體系的抗干擾能力，因此檢測(cè)前的增菌過(guò)程是必要的。

2.4 人工污染食品樣品實(shí)驗(yàn)

將活化的熒光假單胞菌(AS1.55)菌液接入NB培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)至穩(wěn)定期，平板計(jì)數(shù)得初始菌濃度為2.3× 109CFU/mL。將25mL鮮牛奶樣品用選擇性增菌液稀釋10倍，分別接入濃度為23、2.3、0.23CFU/mL的熒光假單胞菌1 mL，每個(gè)濃度平行3次。于0、3、6、9、12、15、24h各取樣1次，煮沸法提取基因組DNA，分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以滅菌蒸餾水為空白對(duì)照。檢測(cè)結(jié)果如表4所示。

表4 人工污染樣品的PCR檢測(cè)結(jié)果Table 4 PCR detection results for artificially contaminated samples

當(dāng)初始接菌量為23CFU/mL時(shí)，增菌培養(yǎng)12h可檢測(cè)到陽(yáng)性結(jié)果；當(dāng)接菌量為2.3CFU/mL時(shí)，增菌培養(yǎng)15h可檢測(cè)到陽(yáng)性結(jié)果；培養(yǎng)24h后，初始接菌量為0.23CFU/mL的樣品檢出率為1/3?？梢姡倔w系在樣品含菌量低的情況下，經(jīng)適當(dāng)時(shí)間增菌可準(zhǔn)確檢測(cè)到熒光假單胞菌存在。

3 討 論

本研究所建立的PCR檢測(cè)體系，可準(zhǔn)確區(qū)分熒光假單胞菌和非熒光假單胞菌，純DNA水平上檢測(cè)靈敏度為14.9fg/μL，純培養(yǎng)物水平上檢測(cè)靈敏度為2.8× 102CFU/mL，當(dāng)背景干擾菌總量為104CFU/mL時(shí)，對(duì)上述體系檢測(cè)靈敏度沒(méi)有影響，而當(dāng)背景干擾菌總量達(dá)到108CFU/mL時(shí)，經(jīng)過(guò)充分增菌培養(yǎng)，也可以準(zhǔn)確檢測(cè)熒光假單胞菌的存在。當(dāng)向不含檢測(cè)目的菌的食品樣品中接入濃度為2.3CFU/mL的熒光假單胞菌后，增菌15h即可準(zhǔn)確檢測(cè)到陽(yáng)性結(jié)果。

本研究設(shè)置的比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，引物16SPSEfluF/R[9]檢測(cè)特異性和純DNA靈敏度結(jié)果與gyrBF/R一致。使用鄧顯文等[11]和Irenehanning等[10]建立的體系對(duì)表1中的菌株進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，發(fā)現(xiàn)屬內(nèi)非熒光假單胞菌株多出現(xiàn)假陽(yáng)性現(xiàn)象。16S r DNA、16～23S rRNA基因間隔區(qū)序列和gyrB基因都是細(xì)菌分子檢測(cè)的常用位點(diǎn)，當(dāng)使用多重序列比對(duì)軟件CLUSTALX進(jìn)行比較分析時(shí)發(fā)現(xiàn)：16S r DNA高度保守，如與銅綠假單胞菌的等位基因同源性達(dá)到95%，種特異性不強(qiáng)，易將不同種判斷為同一菌種而出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果[15]；16～23S rRNA基因間隔區(qū)序列則高度變異，同種不同株(pf-5與pf 0-1)之間同源性僅達(dá)到83%，易錯(cuò)將同一菌種判斷為不同種[15]；gyrB基因也比較保守，與惡臭假單胞菌等位基因同源性為85%，但其片斷上有很多種特異的突變位點(diǎn)，可用來(lái)設(shè)計(jì)特異性的檢測(cè)引物，這主要是由于遺傳密碼子具有兼并性，使得DNA序列可以發(fā)生較多替換而不改變氨基酸序列，尤其對(duì)于密碼子第3位核苷酸，因此，gyrB基因特別適用于菌種間的區(qū)別和鑒定[16]。

通過(guò)CDS比對(duì)篩選得到的檢測(cè)位點(diǎn)，雖然等位基因同源性較高，但序列中間散布著大量突變位點(diǎn)，保守區(qū)段非常短，若用來(lái)設(shè)計(jì)種特異性引物，實(shí)際擴(kuò)增時(shí)，會(huì)出現(xiàn)假陰性現(xiàn)象。針對(duì)這一情況，本實(shí)驗(yàn)嘗試設(shè)計(jì)了一對(duì)簡(jiǎn)并引物Hp2F/R，在多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)中，假單胞菌屬的其他細(xì)菌不時(shí)會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果，即該引物擴(kuò)增結(jié)果不穩(wěn)定，而后進(jìn)行體系優(yōu)化也沒(méi)能解決這一問(wèn)題。本實(shí)驗(yàn)篩選得到的特異位點(diǎn)可作為熒光假單胞菌的分類依據(jù)，為其分子分型方法的建立提供理論支持。

在絕大多數(shù)食品樣品中，檢測(cè)目的菌都以很低的水平存在，而且食品中的各種物質(zhì)和復(fù)雜的背景菌群會(huì)影響檢測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確性，因此，一定時(shí)間的選擇性增菌是必要的。雖然增菌培養(yǎng)會(huì)使檢測(cè)時(shí)間加長(zhǎng)，且使得檢測(cè)結(jié)果不能對(duì)樣品中目的菌準(zhǔn)確定量，但目前大多數(shù)食源性致病菌新型分子檢測(cè)技術(shù)的開發(fā)都以增菌培養(yǎng)作為目的菌濃縮分離的首選方法。與培養(yǎng)法[12]需耗時(shí)約4d相比，本體系準(zhǔn)確檢測(cè)食品中微量存在的熒光假單胞菌，僅需大約1 7 h，大大縮短了檢測(cè)時(shí)長(zhǎng)。

研究[17]表明，gyrB基因是以單拷貝的形式存在于細(xì)菌中的，因此基于gyrB基因的分子檢測(cè)方法可以向定量檢測(cè)的方向發(fā)展。另外，食品中存在的死亡細(xì)菌DNA會(huì)干擾檢測(cè)結(jié)果，降低可信度。相反，RNA僅存在于活菌中，因此，可采用反轉(zhuǎn)錄PCR，針對(duì)RNA進(jìn)行檢測(cè)，彌補(bǔ)現(xiàn)存檢測(cè)體系的漏洞。此外，還可在其他環(huán)節(jié)運(yùn)用輔助手段區(qū)分活菌與死菌，如單疊氮丙錠預(yù)處理PCR(PMA- P CR)。死亡細(xì)菌的細(xì)胞膜會(huì)降解，DNA外泄，PMA可與DNA雙鏈緊密結(jié)合，使其無(wú)法解鏈發(fā)生PCR反應(yīng)。在提取細(xì)菌DNA之前，先用PMA處理菌液，排除掉外泄的DNA，之后再按常規(guī)方法進(jìn)行PCR，即可得到針對(duì)活菌的檢測(cè)結(jié)果[18-19]。

綜上所述，本研究基于gyrB基因建立的PCR檢測(cè)體系可快速、準(zhǔn)確檢測(cè)熒光假單胞菌，靈敏度高，值得推廣使用。

[1] 布坎南 R E, 吉本斯 N E. 伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 1984: 274-312.

[2] LIU M, GRAY J M, GRIFFITHS M W. Occurrence of proteolytic activity and N-acyl-homoserine lactone signals in the spoilage of aerobically chill-stored proteinaceous raw foods[J]. Journal of food protection, 2006, 6(11): 2729-2737.

[3] BRAUN P, BUCHNER S, FEHOHABER K. Amount and heat stability of lipases in food of animal origin[J]. Berliner und Munchener Tierarztliche Wochenschrift, 2002, 115(1-2): 24-29.

[4] LENENETE E H, BALOWS A, WILLIAN J. et al. Manual of clinical microbiology[M]. 4thed. Waghington, DC: American Society for microbiology, 1985: 356-357.

[5] 倪語(yǔ)星, 尚紅. 臨床微生物學(xué)與檢驗(yàn)[M]. 北京: 人民衛(wèi)生出版社, 2007.

[6] 艾億齡, 周善章. 腸汗菌科外的革蘭氏陰性桿菌的鑒定[J]. 國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志, 1982(1): 13-21.

[7] 馬麥生, 趙淑蓮, 趙乃昕, 等. 從冷藏肉蛋中分離出嗜冷的熒光假單胞菌和變形桿菌[J]. 濰坊醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 1993(3): 177-179.

[8] 景慎英, 孫道學(xué). 從變質(zhì)生豬肉中檢出熒光假單胞菌[J]. 中國(guó)食品衛(wèi)生雜志, 1997, 9(3): 28-29.

[9] SCARPELLINI M, FRANZETTI L, GALLI A. Development of PCR assay to identify Pseudomonas fluorescens and its biotype[J]. FEMS Microbiol Letters, 2004, 236(2): 257-260.

[10] HANNING I, JARQUIN R, O, LEARY A, et al. Polymerase chain reaction based assays for the detection and differentiation of poultry significant pseudomonads[J]. Journal of Rapid Methods and Automationin Microbiology, 2009, 17(4): 490-502.

[11] 鄧顯文, 謝芝勛, 劉加波, 等. PCR檢測(cè)診斷羅非魚熒光假單胞菌病技術(shù)的建立[J]. 湖南農(nóng)業(yè)科學(xué), 2010(7): 126-128.

[12] 楊一林. 熒光假單胞菌PCR檢測(cè)靶點(diǎn)的篩選及PCR檢測(cè)體系的建立[D]. 上海: 上海交通大學(xué), 2011.

[13] 陸長(zhǎng)勇. 食源性致病菌多重PCR和基因芯片檢測(cè)方法的建立[D]. 上海: 上海交通大學(xué), 2009.

[14] YU Shuijing, CHEN Wanyi, WANG Dapeng, et al. Species-specific PCR detection of the food-borne pathogen Vibrio parahaemolyticus using the irgB gene identified by comparative genomic analysis[J]. FEMS Microbiology Letters, 2010, 307(1): 65-71.

[15] 畢春霞, 閆志勇, 王斌. 16SrRNA基因及16S～23S rRNA基因區(qū)間在臨床細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)中的應(yīng)用[J]. 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2003, 39(4): 493-498.

[16] 侯曉麗, 曹清毅, 潘勁草. 霍亂弧菌和副溶血弧菌分離株的gyrB基因系統(tǒng)發(fā)育分析[J]. 微生物學(xué)報(bào), 2006, 46(6): 884-889.

[17] 安然, 易圖永, 肖啟明, 等. gyrB基因在細(xì)菌分類和檢測(cè)中的應(yīng)用[J].江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2010, 22(4): 18-20.

[18] KOBAYASHI H, OETHINGER M, TUOHY M J, et al. Distinction between intact and antibiotic-inactivated bacteria by real-time PCR after treatment with propidium monoazide[J]. Journal of Orthopaedic Research, 2010, 28(9): 1245-1251.

[19] CHANG B, TAGULI T, SUGIYAMA K, et al. Comparison of ethidium monoazide and propidium monoazide for the selective detection of viable Legionella cells[J]. Japanese Journal of Infectious Diseases, 2010, 63(2): 119-123.

Development and Evaluation of a PCR Assay for Detection of Pseudomonas fluorescens in Foods

YANG Yi-lin1，ZHOU Min1,*，SHI Chun-lei1，YANG Jie-lin2，SHI Xian-ming1
(1. School of Agriculture and Biology, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China；2. Shanghai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Shanghai 200135, China)

A polymerase chain reaction (PCR) assay for the detection of Pseudomonas fluorescens in foods was developed in this study. Six pairs of detection primers were designed for the 16-23S rDNA internal transcribed spacer sequence, the gyrB gene and 4 specific genes obtained by bioinformatics, respectively. Primary specificity experiments were used to screen the best primer pair out of them. A PCR amplification system targeting the gyrB gene was constructed and evaluated. The results indicated that the developed assay could specifically detect Pseudomonas fluorescens. The specificity was 14.9 fg/μ L for pure DNA, 2.8 × 102CFU/mL for pure culture and 0.28 CFU/ 25 g for soybean milk with 15 h enrichment.

Pseudomonas fluorescens；gyrB gene；polymerase chain reaction (PCR) ；detection；food

TS207.7

：A

1002-6630(2011)20-0185-06

2010-12-30

上海市科學(xué)技術(shù)委員會(huì)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)專項(xiàng)(08DZ0504200)；國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局標(biāo)準(zhǔn)課題(2009IK155)

楊一林(1986—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称钒踩c微生物。E-mail：ickeyyang1215@gmail.com

*通信作者：周敏(1976—)，女，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称钒踩c微生物。E-mail：mzhou2@sjtu.edu.cn