汪同嘉，任云利，王鍵吉

(河南科技大學(xué)化工與制藥學(xué)院，河南洛陽(yáng)471003)

0 前言

開發(fā)后續(xù)能源，保護(hù)環(huán)境，已成為當(dāng)今世界的共識(shí)。生物質(zhì)是一種廣泛存在的可再生資源，生物質(zhì)水解后可以得到木質(zhì)素、纖維素和半纖維素，半纖維素水解后可以得到30% ～80%的木糖［1－2］。若能通過(guò)發(fā)酵將木糖轉(zhuǎn)化為氫氣或乙醇等清潔能源，則對(duì)環(huán)境和能源問(wèn)題的解決具有重要的意義。釀酒酵母是工業(yè)上生產(chǎn)乙醇的優(yōu)良菌株，但由于缺少木糖利用的最初代謝途徑而不能直接利用木糖進(jìn)行乙醇發(fā)酵。多年來(lái)人們?cè)噲D通過(guò)基因工程和細(xì)胞融合等方法對(duì)其進(jìn)行改造使之能夠代謝木糖生產(chǎn)乙醇。然而，所得到的重組酵母或酵母工程菌均因?qū)σ掖肌⒁宜峄蛘咛菨舛鹊妮^低的耐受性造成乙醇生產(chǎn)效率極低［3－4］。從而，將木糖轉(zhuǎn)化為氫氣能源的研究逐漸引起了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。厭氧發(fā)酵制氫技術(shù)由于條件溫和、能耗低，被認(rèn)為是最有應(yīng)用前景的技術(shù)之一。目前常用產(chǎn)氫的微生物中有單一的菌種也有混合菌種?；旌暇嵌喾N微生物的混合體，包括產(chǎn)氫菌和耗氫菌。在厭氧發(fā)酵過(guò)程中，產(chǎn)氫菌產(chǎn)生的氫氣會(huì)很快被耗氫菌消耗，氫氣產(chǎn)量極低。但是一些產(chǎn)氫菌能形成芽孢，在加熱和毒性化學(xué)物質(zhì)存在等不良環(huán)境下，具有比耗氫菌更強(qiáng)的耐受能力。因此，預(yù)處理可以起到抑制耗氫菌活性、篩選產(chǎn)氫菌的作用。近年來(lái)，一些學(xué)者通過(guò)熱處理、酸處理、堿處理等方法來(lái)有效抑制污泥中的耗氫微生物，從而達(dá)到了強(qiáng)化微生物制氫之目的［5－7］。

類似于活性污泥，牛糞堆肥也是多種微生物的混合體，可用于發(fā)酵制氫。近幾年，關(guān)于牛糞堆肥用作發(fā)酵制氫的菌源已有不少報(bào)道［8－9］。但是，通過(guò)對(duì)該混合菌預(yù)處理篩選產(chǎn)氫菌以強(qiáng)化產(chǎn)氫的報(bào)道很少［10］。牛糞用于沼氣發(fā)酵后的發(fā)酵液中富含各種厭氧菌或兼性厭氧菌。因此，本文研究了取自牛糞發(fā)酵液的混合菌以木糖為碳源的產(chǎn)氫能力，并比較了熱處理、酸處理、堿處理和紅外照射處理的最佳處理?xiàng)l件，以及這四種預(yù)處理方法對(duì)混合菌發(fā)酵制氫的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用混合菌取自洛陽(yáng)市生生乳業(yè)沼氣發(fā)酵池。

1.2 培養(yǎng)基

培養(yǎng)基的組成為:木糖15 g/L，蛋白凍5 g/L，磷酸二氫鉀14 g/L，磷酸氫二鉀6 g/L，硫酸銨2 g/L，檸檬酸鈉1 g/L，七水硫酸鎂0.2 g/L。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

將95 mL培養(yǎng)基和5 mL處理好的混合菌倒入500 mL的發(fā)酵瓶中，在CO2吸收瓶中加入適量的NaOH溶液，分別用橡膠塞密封。將發(fā)酵瓶、CO2吸收瓶用乳膠管連接，并向發(fā)酵瓶中鼓吹N2以排出體系中的氧氣。將裝滿水的量氣管和水準(zhǔn)瓶用乳膠管和CO2吸收瓶連接。發(fā)酵前，記下水準(zhǔn)瓶和量氣管液面相平時(shí)的量氣管初始讀數(shù)。然后將發(fā)酵瓶置于37℃水浴搖床，在轉(zhuǎn)速為155 r/min的條件下發(fā)酵。

1.3.1 混合菌的熱處理

取5根試管，分別加入8 mL混合菌液，在沸水浴中分別處理0 min、10 min、20 min、30 min、50 min和90 min，然后各取5 mL進(jìn)行接種。

1.3.2 混合菌的紅外照射處理

取一定量的牛糞堆肥放入培養(yǎng)皿中，在培養(yǎng)皿垂直上方8 cm處用160W的紅外燈泡分別照射1 h，2 h和3 h后，取5 mL接種。

1.3.3 混合菌的酸處理

取一定量的牛糞堆肥，分為5份。用鹽酸分別將其酸堿度調(diào)至pH2，pH3，pH4，pH5，pH6。在37℃恒溫水浴中預(yù)處理24 h后，取5 mL接種。

1.3.4 混合菌的堿處理

取一定量的活性混合菌，分為3份。用NaOH水溶液分別將其酸堿度調(diào)至pH8，pH9，pH10。在37℃恒溫水浴中預(yù)處理24 h。分別取5 mL接種。

1.4 發(fā)酵產(chǎn)氫動(dòng)力學(xué)模型

修正的Gompertz方程能較好地描述間歇實(shí)驗(yàn)中微生物生長(zhǎng)隨時(shí)間的變化規(guī)律［11］，其表達(dá)式為:

式中，H為t時(shí)間內(nèi)的累積產(chǎn)氫量，mL;P為最大累積產(chǎn)氫量，mL;Rm為最大產(chǎn)氫速率，mL/h;λ為產(chǎn)氫延遲時(shí)間，h。在本研究中，每隔1 h記錄發(fā)酵產(chǎn)生的累積產(chǎn)氫量，用上述方程擬合得到P、Rm和λ三個(gè)參數(shù)。然后用下式［12］:

計(jì)算間歇實(shí)驗(yàn)中的產(chǎn)氫速率。

2 結(jié)果與討論

2.1 熱處理時(shí)間對(duì)混合菌產(chǎn)氫的影響

一些產(chǎn)氫菌有更好的環(huán)境耐受能力［13－15］。文獻(xiàn)［16］從牛糞中分離得到1株極端嗜熱產(chǎn)氫菌，可在75℃下發(fā)酵產(chǎn)氫;作者在前期工作中［17］，在100℃熱處理活性污泥10 min后使產(chǎn)氫量提高了1.33倍。通過(guò)熱處理可減少混合菌中的一些耗氫菌和抑氫菌(如乳酸菌)，從而強(qiáng)化產(chǎn)氫。

本實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)不同熱處理時(shí)間處理的混合菌的產(chǎn)氫過(guò)程如圖1所示。從圖1可以看出:混合菌熱處理10 min較未處理所得累計(jì)產(chǎn)氫量并無(wú)明顯變化。然而，當(dāng)混合菌熱處理20～50 min再進(jìn)行接種發(fā)酵所得產(chǎn)氫量可達(dá)310～320 mL，較未處理混合菌所得產(chǎn)氣量提高約30%。當(dāng)熱處理的時(shí)間增加至90 min時(shí)，累計(jì)產(chǎn)氫量則顯著下降。另外，熱處理導(dǎo)致發(fā)酵初期(前5 h)產(chǎn)氫速率下降。當(dāng)熱處理時(shí)間增加至90 min時(shí)，發(fā)酵5 h后幾乎檢測(cè)不到氫氣。

由圖1所示實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合得到Rm、λ和P，擬合的相關(guān)系數(shù)R2均大于0.99。因此，累計(jì)產(chǎn)氫量隨時(shí)間的變化關(guān)系符合Gomperts模型。擬合所得到的3個(gè)參數(shù)被用于計(jì)算間歇實(shí)驗(yàn)的產(chǎn)氫速率(如圖2所示)?？梢?，熱處理10 min的混合菌的產(chǎn)氫速率無(wú)明顯提高;當(dāng)熱處理時(shí)間增加至20～50 min時(shí)，產(chǎn)氫速率可提高46%～85%;當(dāng)熱處理時(shí)間繼續(xù)增加至90 min時(shí)，產(chǎn)氫速率下降16%。這表明時(shí)間過(guò)短的熱處理對(duì)混合菌系影響不大，但過(guò)長(zhǎng)時(shí)間使得產(chǎn)氫菌的生長(zhǎng)受到了威脅。因此實(shí)驗(yàn)所用混合菌的熱處理時(shí)間應(yīng)控制在20～50 min。

2.2 紅外處理時(shí)間對(duì)混合菌產(chǎn)氫的影響

與可見光相比，紅外線具有較長(zhǎng)的波長(zhǎng)，較強(qiáng)的滲透性和較強(qiáng)的穿透組織的能力。遠(yuǎn)紅外射線與傳導(dǎo)加熱相比，在致死溫度以上，細(xì)菌的生存率顯著下降。在40℃(致死溫度)以下，熱能越高細(xì)菌的生存率越低［18］。文獻(xiàn)［9］將牛糞堆肥紅外照射2 h獲得較大的累計(jì)產(chǎn)氫量;文獻(xiàn)［17］利用紅外處理活性污泥1 h，所得累計(jì)產(chǎn)氫量提高了24.6%。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)所用混合菌分別照射1 h，2 h和3 h后發(fā)酵，研究紅外照射時(shí)間對(duì)混合菌產(chǎn)氫的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3和圖4。從圖3和圖4可以看出:紅外照射1 h后的混合菌與未照射的混合菌相比，累計(jì)產(chǎn)氫量未見明顯變化，產(chǎn)氫速率略有增加。紅外照射2 h的混合菌發(fā)酵的產(chǎn)氫速率和累計(jì)產(chǎn)氫量都較未處理的混合菌有一定的增強(qiáng)作用，其中所得累計(jì)產(chǎn)氫量提高約20%，產(chǎn)氫速率提高32%。進(jìn)一步增加紅外照射時(shí)間至3 h混合菌的產(chǎn)氫速率較照射2 h的產(chǎn)氫速率增加20%，但累計(jì)產(chǎn)氫量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。這說(shuō)明1 h的紅外照射時(shí)間對(duì)于混合菌生態(tài)系未造成很大影響;增加紅外照射的時(shí)間至2 h，耗氫菌等一些高熱能細(xì)菌生存率下降，從而使產(chǎn)氫速率和產(chǎn)氫量都得到提高。但繼續(xù)增加紅外照射時(shí)間，產(chǎn)氫菌的生存也會(huì)受到威脅。

2.3 酸處理對(duì)混合菌產(chǎn)氫的影響

取自沼氣發(fā)酵池中的混合菌含有大量的產(chǎn)甲烷微生物，這些微生物適宜在中性或微堿性的環(huán)境中生長(zhǎng)繁殖。產(chǎn)甲烷微生物的最適pH值為6.5～7.5，酸性(pH＜6.0)和堿性(pH＞8.0)環(huán)境對(duì)產(chǎn)甲烷微生物都是不利的。與產(chǎn)甲烷微生物不同的是，很多種產(chǎn)氫菌是耐酸的。例如，文獻(xiàn)［19］篩選得到1株高效厭氧產(chǎn)氫細(xì)菌B49，在pH 3.3仍能生長(zhǎng)，最適pH值為3.9～4.2;文獻(xiàn)［20］篩選到1株遺傳性狀穩(wěn)定的高產(chǎn)氫耐酸突變株，在pH 3.0時(shí)仍能生長(zhǎng)。通過(guò)酸性預(yù)處理，可以抑制耗氫菌［21］和產(chǎn)甲烷菌。

從圖5和圖6可以看出:酸處理對(duì)產(chǎn)氫延遲時(shí)間幾乎沒(méi)有影響，但對(duì)累計(jì)產(chǎn)氫量和產(chǎn)氫速率有一定程度的影響。與未處理的混合菌相比，在pH為3～5的條件下處理的混合菌發(fā)酵所得累計(jì)產(chǎn)氫量可提高10%～20%。酸處理對(duì)產(chǎn)氫速率也有一定的影響，在pH=3條件下處理的混合菌的產(chǎn)氫速率較未處理時(shí)提高約39%。繼續(xù)增加H+的濃度，在pH=1條件下處理的混合菌的累計(jì)產(chǎn)氫量和產(chǎn)氫速率則明顯下降。這是因?yàn)樵谳^強(qiáng)的酸性環(huán)境中，產(chǎn)氫菌受到了融胞的威脅。與未處理的混合菌的發(fā)酵產(chǎn)氫過(guò)程相比，在pH=6的條件下預(yù)處理混合菌的產(chǎn)氫速率未見明顯提高，這可能是過(guò)低的H+濃度對(duì)混合菌系中產(chǎn)氫菌和好氫菌都不能產(chǎn)生較大的影響所致。

2.4 堿處理對(duì)混合菌產(chǎn)氫的影響

從圖7和圖8可以看出:在pH=8的條件下處理混合菌后的產(chǎn)氫過(guò)程較未處理時(shí)無(wú)明顯變化。但在pH=9條件下預(yù)處理混合菌所得產(chǎn)氫速率和累計(jì)產(chǎn)氫量分別達(dá)到22.6 mL/h和320 mL，較未預(yù)處理時(shí)分別提高83%和33%。在pH=10的條件下預(yù)處理牛糞堆肥較pH=9的條件下預(yù)處理的產(chǎn)氫速率和累計(jì)產(chǎn)氫量均有下降。分析以上現(xiàn)象，這是由于較高的OH－濃度使得細(xì)胞膜中的蛋白質(zhì)水解從而破壞了細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞的酶系和結(jié)構(gòu)受到損害甚至分解菌體中的糖類，使耐受OH－能力較差的細(xì)胞(主要為一些耗氫菌)失活，并使其胞內(nèi)物質(zhì)釋放到周圍環(huán)境中，此時(shí)的產(chǎn)氫量和產(chǎn)氫速率都有較大提高。當(dāng)pH超過(guò)10時(shí)，過(guò)高的OH－濃度使產(chǎn)氫菌也受到了一定程度的威脅，從而提前進(jìn)入衰亡期，產(chǎn)氫量和產(chǎn)氫速率都有下降。

3 結(jié)論

本文的研究結(jié)果表明:熱處理、堿處理、酸處理和紅外處理對(duì)產(chǎn)氫的延遲時(shí)間影響較小，但對(duì)產(chǎn)氫量和產(chǎn)氫速率均有一定程度的提高，且產(chǎn)氫量與發(fā)酵時(shí)間的關(guān)系均符合Gompertz模型。不過(guò)，由于不同的預(yù)處理?xiàng)l件對(duì)混合菌系的組成有著不同的影響，因此對(duì)產(chǎn)氫過(guò)程的影響也不相同。其中，熱處理和堿處理對(duì)混合菌發(fā)酵的累計(jì)產(chǎn)氫量和產(chǎn)氫速率的提高程度較大，紅外照射處理和酸處理對(duì)混合菌發(fā)酵產(chǎn)氫的影響相對(duì)較弱。最佳的熱處理?xiàng)l件為100℃，20～50 min，在該條件下累計(jì)產(chǎn)氫量和最大產(chǎn)氫速率較未處理時(shí)分別提高約30%和46%～85%。最佳的堿處理?xiàng)l件為pH=9，時(shí)間為24 h，在該條件下累計(jì)產(chǎn)氫量和產(chǎn)氫速率分別提高33%和83%。最佳的紅外照射處理?xiàng)l件為照射2～3 h，最佳的酸處理?xiàng)l件為pH=3～5，時(shí)間為24 h。

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