熊 濤，黃錦卿，宋蘇華，關(guān)倩倩，謝明勇

(南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047)

植物乳桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化及其高密度培養(yǎng)技術(shù)

熊 濤，黃錦卿，宋蘇華，關(guān)倩倩，謝明勇

(南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047)

應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化植物乳桿菌培養(yǎng)基配方以及利用中和法與指數(shù)流加法優(yōu)化植物乳桿菌高密度培養(yǎng)的發(fā)酵條件。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，進(jìn)一步采用SAS軟件進(jìn)行中心組合設(shè)計(jì)和響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基。優(yōu)化后的培養(yǎng)基配方為：葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)5.43%、蛋白胨質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.98%、K2HPO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.59%。利用15L全自動(dòng)發(fā)酵罐，在接種量3%、pH6.5、培養(yǎng)溫度35℃的最佳條件下，采用氨水中和發(fā)酵培養(yǎng)基和指數(shù)流加碳、氮源，最終發(fā)酵液中植物乳桿菌菌體濃度達(dá)到9.3×109CFU/mL。

植物乳桿菌；響應(yīng)面；培養(yǎng)基優(yōu)化；高密度培養(yǎng)；指數(shù)流加

乳酸菌為人體益生菌[1-4]。乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)品主要有酸奶、奶酪、風(fēng)味泡菜及近年來研究較多的植物發(fā)酵飲料等，因其都具有一定的保健功能而受到越來越多消費(fèi)者的重視和喜愛[5]。直投式發(fā)酵菌劑在蔬菜發(fā)酵工業(yè)中的應(yīng)用越來越廣泛，在發(fā)酵劑的制備過程中，關(guān)鍵環(huán)節(jié)是獲得高濃度的菌體，因此，必須對(duì)乳酸菌進(jìn)行高密度培養(yǎng)[6]。

高密度培養(yǎng)是一個(gè)相對(duì)的概念[7-9]，廣義的講，凡是細(xì)胞密度比較高，以至接近其理論值的培養(yǎng)均可稱為高密度培養(yǎng)。目前，國(guó)內(nèi)研究者對(duì)緩沖鹽法和化學(xué)中和法應(yīng)用較多，但最終獲得的菌體濃度較小，一般不超過109CFU/mL[10]，國(guó)外研究者在細(xì)胞循環(huán)培養(yǎng)法和透析法方面做了許多探索，Hayakawa等[11]以1.3g/(L·h)的產(chǎn)率和0.2m3/kg的耗水量產(chǎn)出了40g/L的干細(xì)胞；Suzuki[12]用陶瓷濾器獲得的最大細(xì)胞干質(zhì)量濃度為141g/L，其產(chǎn)率約為0.8g/(L·h)，耗水量約為0.2m3/kg，用陶瓷濾器的主要缺陷是膜的堵塞，本實(shí)驗(yàn)利用緩沖鹽法、化學(xué)中和法和指數(shù)流加法對(duì)植物乳桿菌進(jìn)行高密度培養(yǎng)，通過在發(fā)酵過程中流加補(bǔ)料，菌體濃度在發(fā)酵終止時(shí)獲得了很大提高，對(duì)乳酸菌大規(guī)模培養(yǎng)以及乳酸菌發(fā)酵劑的制備具有指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

植物乳桿菌(L.plantarum NCU116)由南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基(各成分含量均指質(zhì)量分?jǐn)?shù))：蛋白胨1%、牛肉膏1%、葡萄糖3%、乙酸鈉0.5%、酵母膏0.5%、檸檬酸二銨0.2%、磷酸氫二鉀0.2%、硫酸鎂0.02%、吐溫-80 0.1%，121℃、30min滅菌[13]；平板計(jì)數(shù)培養(yǎng)基：葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%的MRS固體培養(yǎng)基；液體種子培養(yǎng)基：葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%的MRS液體培養(yǎng)基。

1.1.3 儀器與設(shè)備

DHG-9246A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、ZHWY-2102C恒溫培養(yǎng)振蕩器、雷磁PHS-25型數(shù)顯pH計(jì) 上海智城分析儀器制造有限公司；SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；FUS-15L發(fā)酵罐 上海國(guó)強(qiáng)生物設(shè)備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌濃度的測(cè)定

采用菌落平板計(jì)數(shù)法[14]測(cè)定菌落數(shù)，計(jì)算發(fā)酵液中的菌濃度。

1.2.2 還原糖含量的測(cè)定

采用直接滴定法測(cè)定還原糖含量[15]。

1.2.3 種子液的制備

轉(zhuǎn)接斜面菌種于液體種子培養(yǎng)基中，置于36℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h。

1.2.4 發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

1.2.4.1 不同碳源對(duì)植物乳桿菌高密度培養(yǎng)的影響

在MRS液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，選擇蔗糖、麥芽糖、葡萄糖、乳糖以及葡萄糖與乳糖質(zhì)量比1:1的復(fù)合糖5種碳源，質(zhì)量分?jǐn)?shù)都為5%。按2%接種量接種種子液于發(fā)酵培養(yǎng)基中，初始pH6.0，培養(yǎng)溫度36℃，置于恒溫箱內(nèi)靜置培養(yǎng)18h，測(cè)定培養(yǎng)液的菌落數(shù)。

1.2.4.2 不同氮源對(duì)植物乳桿菌高密度培養(yǎng)的影響

在MRS液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，選擇蛋白胨、胰蛋白胨、硫酸銨、硝酸鈉4種氮源，質(zhì)量分?jǐn)?shù)都為1%。按2%接種量接種種子液于發(fā)酵培養(yǎng)基中，初始pH6.0，培養(yǎng)溫度36℃，置于恒溫箱內(nèi)靜置培養(yǎng)18h，測(cè)定培養(yǎng)液的菌落數(shù)。

1.2.4.3 不同緩沖鹽對(duì)植物乳桿菌高密度培養(yǎng)的影響

在MRS液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，選擇CaCO3、K2HPO4、NaAc、KH2PO4作為緩沖鹽，質(zhì)量分?jǐn)?shù)都為0.5%，以不加任何緩沖鹽作為空白對(duì)照。按2%接種量接種種子液于發(fā)酵培養(yǎng)基中，初始pH 6.0，培養(yǎng)溫度36℃，置于恒溫箱內(nèi)靜置培養(yǎng)18h，測(cè)定培養(yǎng)液的菌落數(shù)。

1.2.4.4 不同生長(zhǎng)因子對(duì)植物乳桿菌高密度培養(yǎng)的影響

選擇玉米漿、番茄汁、VC 3種作為生長(zhǎng)因子，質(zhì)量分?jǐn)?shù)都為0.5%，以不添加任何生長(zhǎng)因子作為空白對(duì)照。按2%接種量接種種子液于發(fā)酵培養(yǎng)基中，初始pH 6.0，培養(yǎng)溫度36℃，置于恒溫箱內(nèi)靜置培養(yǎng)18h，測(cè)定培養(yǎng)液的菌落數(shù)。

1.2.4.5 響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基

選擇上述最佳碳源、氮源、緩沖鹽做響應(yīng)面試驗(yàn)。碳源質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別選擇1%、3%、5%、7%、9%，氮源質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別選擇0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%，緩沖鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別選擇0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%，采用三因素三水平，應(yīng)用SAS軟件的響應(yīng)面法優(yōu)化培養(yǎng)基配方[16]。

1.2.5 植物乳桿菌高密度培養(yǎng)條件的優(yōu)化

1.2.5.1 接種量的選擇

選擇不同接種量1%、2%、3%、5%、9%，接種種子液于發(fā)酵培養(yǎng)基中，初始pH6.0，培養(yǎng)溫度36℃，置于恒溫箱內(nèi)靜置培養(yǎng)18h，測(cè)定培養(yǎng)液的菌落數(shù)。

1.2.5.2 溫度的選擇

按最佳接種量接種種子液于發(fā)酵培養(yǎng)基中，初始pH6.0，分別在25、30、35、40、45℃靜置培養(yǎng)18h，測(cè)定其菌落數(shù)。

1.2.5.3 最佳pH值的選擇

選擇pH值分別為7.5、7.0、6.5、6.0、5.0、4.0，在15L發(fā)酵罐內(nèi)分批發(fā)酵，按最佳接種量接種，最佳溫度培養(yǎng)，攪拌速度控制在100r/min，每隔3h測(cè)定菌落數(shù)，選擇其最佳pH值。

1.2.5.4 最終生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

利用15L發(fā)酵罐，按得到最佳條件培養(yǎng)，攪拌速度100r/min，每隔3h測(cè)定菌落數(shù)和還原糖的含量。

1.2.6 高密度培養(yǎng)技術(shù)的研究

1.2.6.1 中和法高密度培養(yǎng)的研究

選擇常用的Na2CO3溶液和氨水為中和劑，利用15L全自動(dòng)發(fā)酵罐，按最終確定的培養(yǎng)條件進(jìn)行發(fā)酵并比較兩種中和劑對(duì)植物乳桿菌高密度培養(yǎng)的影響，以不流加中和劑作對(duì)照，中和劑的質(zhì)量分?jǐn)?shù)都選擇25%，每隔4h測(cè)定菌落數(shù)和還原糖含量。

1.2.6.2 流加法高密度培養(yǎng)的研究

利用15L發(fā)酵罐，比較恒速流加和指數(shù)流加對(duì)植物乳桿菌高密度培養(yǎng)的影響，以確定一種更優(yōu)的流加方式。流加葡萄糖質(zhì)量濃度為300g/L，每隔4h測(cè)定菌落數(shù)和還原糖的含量。

恒速流加：以恒定的流加速度200g/h流加到發(fā)酵罐內(nèi)。

指數(shù)流加：以1.2.5.4節(jié)最終確定的生長(zhǎng)曲線做參考，在菌體生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期開始時(shí)進(jìn)行流加，并且流加速度隨著生長(zhǎng)曲線的變化而變化，初始速度為50g/h，流加速度呈指數(shù)(2n)增加，直至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期。

1.2.6.3 中和法與流加法綜合利用的高密度培養(yǎng)的研究

利用發(fā)酵罐自動(dòng)控制功能，實(shí)現(xiàn)自動(dòng)流加控制，控制最佳pH值，同時(shí)流加碳、氮源，當(dāng)菌體培養(yǎng)進(jìn)行至對(duì)數(shù)期時(shí)，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗殆盡，這時(shí)補(bǔ)充足夠的營(yíng)養(yǎng)物能延續(xù)菌體的生長(zhǎng)。培養(yǎng)過程中同時(shí)添加中和劑中和乳酸菌產(chǎn)生的乳酸，防止罐體內(nèi)培養(yǎng)基的pH值降低。每隔4h測(cè)定菌落數(shù)及還原糖含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

圖1 碳源、氮源、緩沖鹽和生長(zhǎng)因子對(duì)植物乳桿菌高密度培養(yǎng)的影響Fig.1 Effects of carbon source, nitrogen source, buffer salt and growth factor on high-density culture of L. plantarum

2.1.1 碳源的選擇

由圖1a可知，葡萄糖作為碳源時(shí)，菌濃度最高，最適合菌體生長(zhǎng)，可能是因?yàn)橹参锶闂U菌不能利用復(fù)雜的碳水化合物，細(xì)胞內(nèi)缺乏分解多糖的酶，因此多糖類物質(zhì)不適合作為碳源。

2.1.2 氮源的選擇

由圖1b可知，有機(jī)氮源比無機(jī)氮源的效果更好，有機(jī)氮源直接含有植物乳桿菌生長(zhǎng)所需的氮源如氨基酸等物質(zhì)，而無機(jī)氮源需要經(jīng)過合成或轉(zhuǎn)化才能得到氨基酸。由于胰蛋白胨的成本較高，所以選擇蛋白胨作為氮源。

2.1.3 緩沖鹽的選擇

由圖1c可知，K2HPO4作為緩沖鹽的效果最好，而CaCO3的效果最差，可能是因?yàn)镃aCO3在水中的溶解度很低，易形成乳濁液，與乳酸不能充分接觸，也易形成空間阻隔，使菌體不能和培養(yǎng)基充分接觸，造成菌濃度偏低。

2.1.4 生長(zhǎng)因子對(duì)菌濃度的影響

由圖1d可知，玉米漿、VC、番茄汁3種生長(zhǎng)因子中番茄汁促進(jìn)菌體生長(zhǎng)的效果最佳。植物乳桿菌為生長(zhǎng)因子異養(yǎng)型微生物，自身不能合成生長(zhǎng)因子，它們的生長(zhǎng)需要多種生長(zhǎng)因子，如多種維生素等。

2.1.5 碳源、氮源、緩沖鹽添加水平的選擇

圖2 不同葡萄糖、蛋白胨和K2HPO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)菌濃度的影響Fig.2 Effects of glucose, peptone and K2HPO4concentrations on highdensity culture of L. plantarum

2.1.5.1 葡萄糖添加量選擇

由圖2a可以看出，葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)在5%時(shí)菌濃度最高，發(fā)酵培養(yǎng)效果最好。

2.1.5.2 蛋白胨添加量選擇

由圖2b可以看出，當(dāng)?shù)鞍纂速|(zhì)量分?jǐn)?shù)增加到1%時(shí)菌濃度最高，最佳氮源質(zhì)量分?jǐn)?shù)選擇1%。

2.1.5.3 緩沖鹽添加量選擇

由圖2c可以看出，K2HPO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%時(shí)菌濃度最高，發(fā)酵培養(yǎng)效果最好。

2.1.6 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

2.1.6.1 響應(yīng)面方差分析結(jié)果

通過單因素試驗(yàn)并且確定重要因素最佳質(zhì)量分?jǐn)?shù)的取值區(qū)間，利用SAS V8.0分析軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，見表 1、2。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素和水平表Table 1 Factors and levels in response surface design

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 2 Scheme and results of response surface design

對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，擬合得回歸方程為：Y=4.763333+0.395X1+0.0825X2+0.7075X3-1.239167X12-1.354167X22-0.904167X32-0.185X1X2+0.3X1X3-0.54X2X3。

由表3方差分析可知，X1、X12、X3、X22、X32、X2X3對(duì)響應(yīng)值的影響顯著，說明葡萄糖、蛋白胨、K2HPO4是植物乳桿菌NCU116發(fā)酵培養(yǎng)基成分的重要控制因素。失擬項(xiàng)P=0.6057，沒有顯著性意義。從模型可信度分析表4可見，回歸方程復(fù)相關(guān)系數(shù)R2=97.63%，說明回歸方程擬合度良好，失擬較小，可用于培養(yǎng)基的優(yōu)化。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析表Table 3 Variance analysis of the established regression equation for cell density of L. plantarum

表4 模型的可行度分析Table 4 Feasibility analysis of the established regression equation for cell density of L. plantarum

2.1.6.2 響應(yīng)面優(yōu)化最佳條件

根據(jù)上述回歸方程繪出響應(yīng)面分析圖及等高線圖，研究葡萄糖、蛋白胨、K2HPO43個(gè)因素對(duì)發(fā)酵的影響，響應(yīng)面和等高線圖見圖3～5。

圖3 Y=f(X1, X2)的響應(yīng)面及其等高線圖Fig.3 Response surface and contour plots of Y=f(X1, X2)

圖4 Y=f(X1, X3)的響應(yīng)面及其等高線圖Fig.4 Response surface and contour plots of Y=f(X1, X3)

圖5 Y=f(X2,X3)的響應(yīng)面及其等高線圖Fig.5 Response surface and contour plots of Y=f(X2, X3)

從圖3～5可看出，兩兩因素之間存在比較明顯的交互作用，最佳點(diǎn)落在試驗(yàn)考察區(qū)域內(nèi)。為進(jìn)一步求得最佳點(diǎn)值，對(duì)回歸方程分別求一階偏導(dǎo)數(shù)，得到最后的最佳值分別為X1=5.43%、X2=0.98%、X3=0.59%，菌體濃度4.76×109CFU/mL。

2.1.6.3 優(yōu)化條件的驗(yàn)證

用響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化后的理論值做驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。以所得最佳反應(yīng)條件：葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)5.43%、蛋白胨質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.98%、K2HPO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.59%進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，得到菌體濃度為4.68×109CFU/mL，擬合度為97.63%，表明預(yù)測(cè)值和真實(shí)值之間有很好的擬合性，進(jìn)一步驗(yàn)證了模型的可靠性。

2.2 植物乳桿菌高密度培養(yǎng)條件

圖6 接種量和培養(yǎng)溫度對(duì)菌濃度的影響Fig.6 Effects of inoculation amount and culture temperature on cell density of L. plantarum

2.2.1 接種量的選擇

由圖6可見，接種量在3%時(shí)，菌體生長(zhǎng)效果最佳。接種量在9%時(shí)菌濃度偏低，接種量過高，菌體生長(zhǎng)不好，可能是因?yàn)樵诎l(fā)酵初始階段培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不能滿足大量菌體生長(zhǎng)的需求。

2.2.2 培養(yǎng)溫度的確定

由圖6可知，溫度對(duì)植物乳桿菌的影響比較明顯，在35℃時(shí)，菌體濃度達(dá)到5.4×109CFU/mL。溫度變化會(huì)直接影響菌體內(nèi)蛋白質(zhì)、酶的活性，溫度過高會(huì)使得細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)變性，影響核糖體、RNA等大分子的穩(wěn)定性；溫度過低會(huì)降低酶活力，引起細(xì)胞膜流動(dòng)性的變化，從而影響菌體的正常生長(zhǎng)。

2.2.3 最佳pH值的確定

由圖7可知，在pH6.5時(shí)，菌體生長(zhǎng)最好，而在pH4.0時(shí)，菌體生長(zhǎng)緩慢，pH值越低，植物乳桿菌所受酸脅迫的影響越大，所以最佳pH值應(yīng)該控制在6.5左右。

圖7 pH值對(duì)菌濃度的影響Fig.7 Effect of pH on cell density of L. plantarum

2.2.4 植物乳桿菌最終生長(zhǎng)曲線

確定培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件，利用15L發(fā)酵罐培養(yǎng)植物乳桿菌，繪制其菌濃度生長(zhǎng)曲線以及還原糖含量曲線，結(jié)果如圖8所示。

圖8 植物乳桿菌生長(zhǎng)曲線及還原糖含量變化Fig.8 Growth curve of L. plantarum and sugar content change

由圖8可知，得到最佳培養(yǎng)基條件和培養(yǎng)條件后，菌體的最佳收獲期是在20h左右，后續(xù)實(shí)驗(yàn)以這個(gè)收獲期為收獲依據(jù)。

2.3 植物乳桿菌高密度培養(yǎng)技術(shù)的研究

2.3.1 中和法對(duì)高密度培養(yǎng)的影響

利用發(fā)酵罐，選擇氨水、Na2CO3溶液作為中和劑，并且研究?jī)煞N中和劑對(duì)發(fā)酵的影響，其生長(zhǎng)曲線如圖9所示。

圖9 中和劑對(duì)菌濃度的影響Fig.9 Effect of neutralizer on cell density of L. plantarum

參考生長(zhǎng)曲線圖與不添加中和劑對(duì)比，由圖9可知，流加中和劑氨水后植物乳桿菌高密度培養(yǎng)最高菌濃度比不添加中和劑要高，達(dá)到6.8×109CFU/mL。在植物乳桿菌的培養(yǎng)過程中，由于其代謝物質(zhì)會(huì)對(duì)菌體的繁殖產(chǎn)生抑制作用，pH值降低，從而影響菌體繼續(xù)繁殖。植物乳桿菌在高密度培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的酸量較大，使得植物乳桿菌的耐受性不能降低酸對(duì)菌體產(chǎn)生的脅迫效應(yīng)。在培養(yǎng)過程中加入中和劑，使培養(yǎng)過程的pH值保持穩(wěn)定，可以去除酸脅迫。

2.3.2 流加方式對(duì)高密度培養(yǎng)的影響

圖10 流加方式對(duì)菌濃度和還原糖含量的影響Fig.10 Effect of feeding batch mode on cell density of L. plantarum and reducing sugar content

由圖10可知，指數(shù)流加培養(yǎng)的效果最佳，菌濃度能達(dá)到6.6×109CFU/mL，而恒速流加能達(dá)到5.5× 109CFU/mL，兩種流加培養(yǎng)方式的菌濃度都高于非流加培養(yǎng)。

在高密度培養(yǎng)早期，細(xì)胞濃度較低，流加速率必須控制在較低水平，葡萄糖過量會(huì)影響植物乳桿菌發(fā)酵，而隨著細(xì)胞的生長(zhǎng)，碳源和氮源不斷被大量消耗，菌體生長(zhǎng)速率也隨之降低。指數(shù)流加是根據(jù)菌體的生長(zhǎng)曲線以及還原糖含量進(jìn)行流加，其流加速率與生長(zhǎng)曲線和還原糖含量同步，在指數(shù)生長(zhǎng)區(qū)間進(jìn)行流加；而恒速流加只是在發(fā)酵初期能滿足細(xì)菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的要求，隨著細(xì)胞生長(zhǎng)，碳、氮源消耗過快，則不能滿足菌體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的需求。綜上所述，本實(shí)驗(yàn)選擇指數(shù)流加方法對(duì)植物乳桿菌進(jìn)行高密度培養(yǎng)。

2.3.3 中和法和指數(shù)流加法綜合利用對(duì)高密度培養(yǎng)的影響

圖11 中和法和指數(shù)流加綜合利用的菌體生長(zhǎng)曲線和還原糖含量變化Fig.11 Combined effect of neutralization and exponential feeding method on cell density of L. plantarum and reducing sugar content

如圖11所示，中和法與指數(shù)流加法綜合應(yīng)用于植物乳桿菌高密度培養(yǎng)時(shí)效果明顯，可以提高菌體的生長(zhǎng)速率，最終菌濃度達(dá)到9.3×109CFU/mL。中和法和指數(shù)流加法相結(jié)合的綜合利用不僅能消除乳酸對(duì)菌體的酸脅迫效應(yīng)，還能滿足菌體在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期大量營(yíng)養(yǎng)物的需求。

3 結(jié) 論

以植物乳桿菌NCU116為實(shí)驗(yàn)菌種進(jìn)行高密度培養(yǎng)，經(jīng)過單因素試驗(yàn)以及響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)分析，最終得到發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)5.43%、蛋白胨質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.98%、K2HPO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.59%，在接種量為3%、培養(yǎng)溫度35℃、pH6.5，中和法和指數(shù)流加綜合利用，培養(yǎng)結(jié)束后最終菌濃度達(dá)到9.3×109CFU/mL。

[1] 張剛. 乳酸細(xì)菌: 基礎(chǔ)、技術(shù)和應(yīng)用[M]. 北京: 化學(xué)工業(yè)出版社, 2007: 212- 266.

[2] GARDNER N J, SAVARD T, OBERMEIER P, et al. Selection and characterization of mixed starter cultures for lactic acid fermentation of carrot, cabbage, beet and onion vegetable mixtures[J]. International Journal of Food Microbiology, 2001, 64(3): 261-275.

[3] 吳祖芳, 劉璞, 翁佩芳. 榨菜加工中乳酸菌技術(shù)的應(yīng)用及研究進(jìn)展[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2005, 31(8): 73-76.

[4] 吳祖芳, 劉璞, 翁佩芳. 傳統(tǒng)榨菜腌制加工應(yīng)用乳酸菌技術(shù)的研究[J]. 食品工業(yè)科技, 2008(2): 101-103.

[5] 申彤, 徐靜. 植物原料乳酸菌發(fā)酵劑增菌培養(yǎng)的研究[J]. 食品科技, 2006(9): 47- 49.

[6] PEEBLES M M, GILLILAVD S E, SPECK M L. Preparation of concentrated lactic streptococcus starters[J]. Appl Microbiol, 1969, 17(1): 805-810.

[7] 張安平. 重組大腸桿菌培養(yǎng)條件的優(yōu)化及其高密度發(fā)酵的初步研究[D]. 北京: 中國(guó)科學(xué)院化工冶金研究所, 1996.

[8] 陳洪章, 李佐虎. 酵母菌的高密度發(fā)酵[J]. 工業(yè)微生物, 1998, 28(1): 28-31.

[9] 李民, 陳常慶. 重組大腸桿菌高密度發(fā)酵研究進(jìn)展[J]. 生物工程進(jìn)展, 2000, 20(2): 26-30.

[10] 靳志強(qiáng), 李平蘭. 補(bǔ)料分批法高密度培養(yǎng)德氏乳桿菌保加利亞亞種S-1[J]. 中國(guó)乳品工業(yè), 2007, 35(1): 4-9.

[11] HAYAKAWA K, SANSAWA H, NAGUMEME T. High density culture of Lactobacillus casei by cross flow culture flow culture method based on kinetic properties of the micorganism[J]. Ferment Bioeng, 1990, 70 (1): 404-405.

[12] SUZUKI T. A dense cell culture system for microorganisms using a stirred ceramic filters[J]. Ferment Bioeng, 1996, 82(1): 264-271.

[13] 熊澤, 仇敏, 邵偉, 等. 瑞士乳桿菌凍干發(fā)酵劑制備中保護(hù)劑的選擇[J]. 冷飲與速凍食品工業(yè), 2006, 12(3): 20-21; 24.

[14] 張艷, 劉均娥, 張晶, 等. 平板活菌計(jì)數(shù)法檢測(cè)糞便中的腸道菌群[J].首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2008, 29(1): 85-86.

[15] 中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì). GB/T 5009.7—2008 食品中還原糖的測(cè)定[S]. 北京: 中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2008.

[16] SOLIMAN N A, BEREKAA M M, ABDEL-FATTAH Y R. Polyglutamic acid (PGA) production by Bacillus sp. SAB- 26: Application of Plackett-Burman experimental design to evaluate culture requirements[J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2005, 69(1): 259-267.

Lactobacillus plantarum: Optimization of Fermentation Medium and Investigation of High-density Culture Methods

XIONG Tao，HUANG Jin-qing，SONG Su-hua，GUAN Qian-qian，XIE Ming-yong
(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

In this study, response surface methodology was applied to optimize medium composition for Lactobacillus plantarum, and high-density cultivation of L. plantarum was optimized by neutralization and exponential feeding method. On the basis of single-factor experiments, the optimal fermentation medium formula was determined by central composite design combined with response surface methodology to be made up of 5.43% glucose, 0.98% peptone and 0.59% K2HPO4. Ammonia neutralization and exponential feeding carbon and nitrogen sources together operated in a 15 L fermenter under the optimal conditions (inoculation amount of 3%, pH 6.5 and cultivation temperature of 35 ℃) resulted in a final cell concentration of up to 9.3×109CFU/mL.

L. plantarum；response surface；medium optimization；high-density culture；exponential feeding batch

TS201.3

A

1002-6630(2011)07-0262-07

2010-07-26

教育部留學(xué)回國(guó)人員創(chuàng)業(yè)基金項(xiàng)目；江西省青年科學(xué)家(井岡之星)培養(yǎng)項(xiàng)目(2009年135號(hào))

熊濤(1970—)，男，教授，博士研究生，研究方向?yàn)榧?xì)胞工程和酶工程。E-mail：xt-ncu@hotmail.com