李成磊，蒙 華，張曉偉，陳 惠，邵繼榮，吳 琦*

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與理學(xué)院，四川 雅安 625014)

甜蕎苯丙氨酸解氨酶基因PAL的克隆及序列分析

李成磊，蒙 華，張曉偉，陳 惠，邵繼榮，吳 琦*

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與理學(xué)院，四川 雅安 625014)

利用RT-PCR技術(shù)，首次從甜蕎(Fagopyrum esculentum)中克隆得到苯丙氨酸解氨酶基因(PAL)的cDNA ORF序列，命名為FePAL。該序列長2169bp，編碼722個(gè)氨基酸，與其他植物PAL基因同源性較高，為80%～97%，其推導(dǎo)的氨基酸序列含有PAL酶活性中心特征序列GTITASGDLVPLSYIA和多個(gè)脫氨基、催化活性位點(diǎn)。系統(tǒng)發(fā)育樹表明，甜蕎PAL基因與苦蕎PAL基因聚類關(guān)系最近。

甜蕎；苯丙氨酸解氨酶基因；克?。恍蛄蟹治?/p>

甜蕎(Fagopyrum esculentum)又稱普通蕎麥，為蓼科蕎麥屬雙子葉植物，是我國蕎麥的主要栽培品種之一。它起源于我國西南部，現(xiàn)已在世界范圍內(nèi)作為一種小糧作物而被廣泛種植。甜蕎是藥食同源作物，籽粒除含高生物價(jià)的蛋白質(zhì)、VE、VPP和微量礦質(zhì)元素硒外，還含有其他糧食作物中少有的黃酮類化合物(主要成分為蘆丁)。這些化合物在清除自由基、抗氧化、降血脂和改善胰島功能等方面具有獨(dú)特的效果[1-3]，因此作為一種既有營養(yǎng)價(jià)值又具保健作用的傳統(tǒng)作物，甜蕎具有很高的開發(fā)利用價(jià)值[4-5]。

黃酮類化合物是植物苯丙烷類代謝途徑中的次生代謝產(chǎn)物，該途徑反應(yīng)眾多，由多種酶共同催化完成，苯丙氨酸氨解酶(phenylalanine ammonia-lyase，PAL)則是連接初級代謝和次級代謝，催化該途徑第一步反應(yīng)的酶，也是該途徑的關(guān)鍵酶和限速酶。它催化L-苯丙氨酸解氨生成反式肉桂酸，再由反式肉桂酸生成香豆酸、芥子酸等中間產(chǎn)物；此后，在不同酶的催化作用下，中間產(chǎn)物經(jīng)不同分支進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為類黃酮、木質(zhì)素和酚類等次生代謝產(chǎn)物。這些次生代謝產(chǎn)物在植物的生長發(fā)育及抗病抗逆過程中均起著重要的作用[6-10]。

一直以來文獻(xiàn)都報(bào)道甜蕎黃酮類化合物含量低于另一栽培種苦蕎(Fagopyrum tataricum)[11-12]，但由于甜蕎籽粒具有個(gè)大、易脫皮、出粉率高等特點(diǎn)仍被廣泛種植，若能提高甜蕎黃酮類含量更能提升其種植價(jià)值?，F(xiàn)在，應(yīng)用基因工程對植物次生代謝途徑的遺傳特性進(jìn)行改造以提高特定產(chǎn)物含量、改良植物品質(zhì)，已發(fā)展為具有廣闊應(yīng)用前景的熱點(diǎn)研究領(lǐng)域，而要達(dá)到這個(gè)目的，次生代謝途徑中關(guān)鍵酶基因的克隆顯得尤為重要。本研究以阿壩甜蕎為材料，采用RT-PCR技術(shù)克隆其PAL的cDNA開放閱讀框(open reading frame，ORF)序列并進(jìn)行分析，為逐步揭示其次生代謝途徑及利用關(guān)鍵酶基因調(diào)控甜蕎黃酮類化合物的積累提供分子生物學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試甜蕎種子購于四川阿壩農(nóng)戶，種植于四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生物系實(shí)驗(yàn)基地。經(jīng)邵繼榮教授鑒定，符合甜蕎種的特征。

質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒、膠回收試劑盒 Omega公司；rTaqDNA聚合酶、克隆載體pMD19-T Takara公司；RNA提取試劑植物RNAout試劑盒 天澤基因工程有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit Fermentas公司。

1.2 儀器與設(shè)備

高速冷凍離心機(jī) Thermo Electron Corporation；MyCyclerTM PCR、儀凝膠成像系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司；DYY-Ⅲ-68型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀 北京市六一儀器廠；DNP-9272型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 甜蕎花總RNA提取及甜蕎PAL基因cDNA ORF序列的克隆

采用植物RNAout試劑盒提取甜蕎新鮮花總RNA，以O(shè)ligo-dT為引物進(jìn)行RT-PCR獲得cDNA。以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，參照Genbank中已登錄的苦蕎PAL基因(GQ285125)序列設(shè)計(jì)一對特異引物TPALf：5′-GC AATGGGGGTCTCAAACG-3′；TPALr：5′-TTTTT CCTAGCAGATAGGCA-3′擴(kuò)增甜蕎PAL基因cDNA ORF序列。在200μL EP管中依次加入：ddH2O 34μL、10× Buffer 5μL、25mmol/LMgCl23μL、dNTP mixture 3μL、20μmol/L上下游引物各1.5μL、模板cDNA 1μL、Taq DNA聚合酶1μL(5U/μL)，總體積50μL。反應(yīng)條件為：94℃、5min；94℃、1min，55℃、1min，72℃、1min，共30個(gè)循環(huán)；72℃、8min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收后連接至pMD 19-T進(jìn)行克隆，篩選出陽性克隆后送北京諾賽基因組研究中心有限公司進(jìn)行測序。

1.3.2 生物信息學(xué)分析

借助NCBI在線工具Blast進(jìn)行甜蕎PAL核苷酸序列和蛋白質(zhì)序列的同源性分析，利用Clustal X1.81對甜蕎PAL進(jìn)行多序列比對后采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 甜蕎花總RNA的提取

提取的總RNA經(jīng)2%瓊脂糖電泳結(jié)果見圖1。28S rRNA和18S rRNA條帶清晰可見，亮度比在1:1至2:1之間，表明RNA基本未降解，可用于RT-PCR。

圖1 甜蕎花總RNAFig.1 Total RNA extracted from the flower of F. esculentum

2.2 甜蕎PAL基因cDNA ORF序列的克隆

以甜蕎新鮮花總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，用特異引物PCR擴(kuò)增得到約2200bp的特異帶(圖2)。

圖2 PAL基因cDNA ORF的PCRFig.2 Agarose gel electrophoresis of PCR amplification products of cDNA ORF of PAL

2.3 甜蕎PAL基因序列分析

甜蕎PAL基因cDNA擴(kuò)增產(chǎn)物測序結(jié)果經(jīng)拼接后得到了長為2169bp的核苷酸序列。該cDNA序列包含一個(gè)完整的開放閱讀框，編碼722個(gè)氨基酸(圖3)，將該序列命名為FePAL，并提交GenBank，登錄號為GU363529。

通過NCBI在線比對工具Blast將FePAL序列同其他物種PAL進(jìn)行比對，結(jié)果表明其核苷酸序列與苦蕎PAL基因(GQ285125)同源性達(dá)到97%，其次與藿香(Agastache rugosa，AF326116)同源性為74%，與蕓苔(Brassica napus，AY795080)、葡萄(Vitis vinifer，EF192469)和山萵苣(Lactuca sativa，AF411134)等同源性均為73%。

將FePALcDNA推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行同源性比對，結(jié)果表明：FePAL氨基酸序列與苦蕎(ACT68010)同源性最高為97%，與毛果楊(Populus trichocarpa，ACC63889)、麻風(fēng)樹(Jatropha curcas，ABI33979)和歐芹(Petroselinum crispum，CAA57057)等具有80%左右的同源性。且經(jīng)Blast P分析顯示FePAL編碼的蛋白質(zhì)具有PAL-HAL功能域，第66～532的肽段與PAL同源性很高，除含有一個(gè)酶活性中心特征序列GTITASGDL VPLSYIA外，還存在多個(gè)酶活性位點(diǎn)(圖3)。這些活性位點(diǎn)與玉米和擬南芥的活性位點(diǎn)比較相似[13-14]，說明FePAL是PAL蛋白質(zhì)家族中的一員。

圖3 FePAL基因cDNA ORF序列和推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.3 cDNA ORF and deduced amino acid sequences of FePAL

2.4 分子進(jìn)化分析

圖4 甜蕎PAL與其他植物PAL氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of FePAL and PAL from other plants based on amino acid sequences

經(jīng)Clustal X1.81進(jìn)行多序列比對后，采用鄰接法構(gòu)建基于甜蕎PAL氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4)。由圖看出，相同科的植物多處于同一分支，如豆科的大豆(Glycine max)、紫苜蓿(Medicago sativa)和黃芪(Astragalus mongholicus)等。同為蓼科的甜蕎與苦蕎親緣關(guān)系最近，也單獨(dú)構(gòu)成一個(gè)分支，與毛果楊、葡萄等其他植物關(guān)系較遠(yuǎn)。

3 討 論

苯丙烷類代謝途徑是植物重要的次生代謝途徑之一，PAL作為該途徑的第一個(gè)關(guān)鍵酶和限速酶，其活性的高低與該途徑終產(chǎn)物如類黃酮、木質(zhì)素和植保素等的積累有著密切的關(guān)系。劉金富等[15]研究了苦蕎發(fā)芽過程黃酮含量的變化規(guī)律，認(rèn)為PAL活性升高，黃酮合成也會(huì)增加。程水源等[16]研究銀杏葉黃酮含量與PAL活性變化得出：PAL活性變化與銀杏葉黃酮含量變化幾乎同步，呈顯著正相關(guān)，并確定PAL是銀杏葉黃酮合成過程中關(guān)鍵酶之一。蘋果PAL的活性與黃酮類化合物花青苷生物合成的研究表明，在蘋果幼果中，花青苷合成與PAL活性呈一定的相關(guān)性[17]。原永兵等[18]認(rèn)為，PAL活性的變化與簡單酚含量變化一致。由此可見，通過增強(qiáng)PAL的活力，可以在一定程度上提高植物中類黃酮物質(zhì)的含量。

類黃酮物質(zhì)作為一種重要的次生代謝產(chǎn)物，它在植株中的高水平積累不僅能夠提升植物品質(zhì)，對植株本身而言，也能提高其抗病抗脅迫的能力。近年來利用基因工程技術(shù)通過關(guān)鍵酶基因?qū)χ仓赀M(jìn)行遺傳品質(zhì)的改良是研究的熱點(diǎn)。PAL作為類黃酮代謝途徑中的關(guān)鍵酶和限速酶，本研究首次克隆了甜蕎PAL基因cDNA ORF，為利用基因工程技術(shù)調(diào)控甜蕎類黃酮的代謝，增加其類黃酮物質(zhì)的積累提供參考。

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Cloning and Sequence Analysis of Phenylalanine Ammonia-lyase (PAL) Gene from Fagopyrum esculentum

LI Cheng-lei，MENG Hua，ZHANG Xiao-wei，CHEN Hui，SHAO Ji-rong，WU Qi*
(College of Life Science, Sichuan Agricultural University, Ya’an 625014, China)

The cDNA ORF sequence of phenylalanine ammonia-lyase gene (FePAL) from Fagopyrum esculentum was cloned by RT-PCR. The cDNA sequence was 2169 bp in length, encoding 722 amino acids and had a high homology (80%-97%) with PAL genes from other plants. The deduced amino acid sequence of FePAL contained the typical sequence (GTTTASGDLVPLSYIA) in PAL activity center region, deamination residues and catalytic active sites. Phylogenetic tree analysis revealed that FePAL was most closely related to the PAL of Fagopyrum tataricum.

Fagopyrum esculentum；phenylalanine ammonia-lyase gene；cloning；sequence analysis

Q943.2；S517.032

A

1002-6630(2011)07-0255-03

2010-07-04

四川省科技廳科技攻關(guān)項(xiàng)目(04NG001-015；2006Z08-012)

李成磊(1983—)，男，博士研究生，研究方向?yàn)榛蚬こ?。E-mail：lichenglei1998@yahoo.com.cn

*通信作者：吳琦(1973—)，男，副教授，博士，研究方向?yàn)榛蚬こ?。E-mail：wuqiwq@yahoo.cn