曹思碩，許文濤,，冉文君，梁立興，賀曉云，羅云波，元延芳，黃昆侖,,*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；2.農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因生物食用安全監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心(北京)，北京 100083)

大腸桿菌中表達(dá)Cry1C基因及其重組表達(dá)產(chǎn)物的純化及復(fù)性

曹思碩1，許文濤1,2，冉文君1，梁立興1，賀曉云2，羅云波1，元延芳2，黃昆侖1,2,*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；2.農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因生物食用安全監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心(北京)，北京 100083)

通過(guò)PCR方法將蘇云金芽孢桿菌Cry1C基因從原始質(zhì)粒中克隆出來(lái)。由于Cry1C基因攜帶了大量大腸桿菌稀有密碼子，因此用PCR方法對(duì)其前86個(gè)密碼子進(jìn)行修改，以提高其在大腸桿菌BL21(DE3)中的表達(dá)量。Cry1C蛋白在大腸桿菌BL21(DE3)中以包涵體形式大量表達(dá)，將包涵體用8mol/L尿素溶解并用His TrapTMFF凝膠柱純化。所得純化蛋白在復(fù)性緩沖液中復(fù)性折疊，最終得到可溶并有生物活性(由三化螟活性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證)的蛋白。Cry1C蛋白純度可達(dá)99.2%。

Cry1C蛋白；稀有密碼子；包涵體；表達(dá)；純化；復(fù)性折疊

蘇云金芽孢桿菌是一種革蘭氏陽(yáng)性產(chǎn)孢細(xì)菌，該菌體能分泌一種特殊的抗蟲(chóng)晶體蛋白，被命名為δ-內(nèi)毒素，是目前主要的生物農(nóng)藥之一[1]。蘇云金芽孢桿菌的內(nèi)毒素按氨基酸序列相似性被分為兩類，Cry和Cyt δ-內(nèi)毒素[2-3]。Cry毒素對(duì)多種有害昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)具有毒性，如鱗翅目、雙翅目、鞘翅目[4]、膜翅目、同翅目、直翅目、食毛目，線蟲(chóng)類、螨類和原生動(dòng)物等[5-6]。此類毒素已經(jīng)在商業(yè)化農(nóng)業(yè)、森林管理和蚊蟲(chóng)控制中作為化學(xué)合成農(nóng)藥的替代品被廣泛應(yīng)用。Cry毒素還能被轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)基因植物中使其具有抗蟲(chóng)特性[1]。

自從Schnepf等[7]在1981年從HD21Dipel中克隆出第一個(gè)Cry基因以來(lái)，已有433種晶體蛋白基因被克隆。這些基因按照它們的氨基酸序列可以被分為49種，93個(gè)亞種，147類，328小類[2]。這些毒素其中Cry1A類毒素被廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因植物，致使有些幼蟲(chóng)對(duì)該種作物產(chǎn)生抗性。Cry1C毒素能有效抵抗鱗翅目害蟲(chóng)，可作為Cry1A毒素的替代物或與Cry1A毒素融合表達(dá)得到新的抗蟲(chóng)蛋白。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)PCR對(duì)Cry1C基因進(jìn)行突變后將該基因連接到pET28a(+)載體上，在大腸桿菌的細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行表達(dá)。重組融合蛋白經(jīng)過(guò)洗滌包涵體后用8mol/L尿素溶解，用His TrapTMFF凝膠柱純化，之后在復(fù)性緩沖液中復(fù)性得到活性蛋白。此蛋白可被應(yīng)用于Cry1C蛋白的安全性評(píng)價(jià)，為轉(zhuǎn)Cry1C蛋白的水稻商業(yè)化生產(chǎn)提供參考依據(jù)。通過(guò)大量發(fā)酵生產(chǎn)的Cry1C蛋白還能作為生物農(nóng)藥以減少化學(xué)合成農(nóng)藥的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒

含有Cry1C基因的質(zhì)粒由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)林擁軍老師惠贈(zèng)；大腸桿菌DH5α、BL21(DE3)菌株及原核表達(dá)載體pET-28a(+)由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 酶與試劑

T4 DNA連接酶、pGEM-T載體 美國(guó)Promega公司；Taq DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶 日本Takara公司；DNA Marker DL2000、DNA回收試劑盒 天根生化科技(北京)有限公司；低分子質(zhì)量蛋白質(zhì)Marker 北京全式金生物技術(shù)有限公司；凝膠柱 美國(guó)Amersham Biosciences公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 Cry1C基因密碼子優(yōu)化

用修改后的上游引物5＇-TGGAGGAGAACAA TCAGAACCAGTGTATCCCGTACAATTGTCTGA GCAATCCGGAAGAAGTTCTGCTGGATGGCG AACGCATCTC-3＇和下游引物5＇-TCATCACT TTTGTGCGCGTTCAAGGTCAGATTCTGC -3＇從原質(zhì)粒中擴(kuò)增并修改Cry1C基因[8]。5＇端的稀有密碼子被替換結(jié)果如圖1所示。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并回收目的條帶后通過(guò)T4 DNA 連接酶于4℃連接過(guò)夜至pGEM-T載體，然后轉(zhuǎn)化至E. coli DH5α。轉(zhuǎn)化株首先經(jīng)過(guò)藍(lán)白斑篩選，之后再用PCR鑒定及測(cè)序鑒定。被修改后的基因被命名為Cry1C-rcp基因。

圖1 Cry1C基因前86個(gè)堿基修改密碼子Fig.1 Modified triplets in the first 86 nucleotides of Cry1C gene.

1.4 構(gòu)建重組表達(dá)載體

通過(guò)帶有酶切位點(diǎn)的上游引物 5＇-GCGGATCCT CATCACTTTTGTGCGC -3＇(下劃線部分為BamH I 酶切位點(diǎn))和下游引物5＇-GGAATTCCATATG GAGG AGAACAATCAGAACC-3＇(下劃線部分為Nde I 酶切位點(diǎn)) PCR擴(kuò)增Cry1C-rcp基因， PCR產(chǎn)物經(jīng)BamH I 和Nde I酶切后插入pET-28a(+)的BamH I和Nde I位點(diǎn)。將此質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α，提取轉(zhuǎn)化株質(zhì)粒經(jīng)BamH I 和Nde I酶切鑒定及測(cè)序鑒定后，轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21 (DE3)表達(dá)Cry1C蛋白。

1.5 表達(dá)重組蛋白

重組蛋白在含有100μg/mL卡那霉素的LB (1% 胰化蛋白胨、0.5%酵母提取物、1% NaCl)培養(yǎng)基中表達(dá)。將6mL的過(guò)夜培養(yǎng)物加入200mL的新鮮培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)。在OD600nm為0.6～1.0時(shí)考察不同IPTG濃度、溫度和誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)表達(dá)重組蛋白的影響。12000r/min離心10 min收集菌體，通過(guò)SDS-PAGE電泳分析得到最適的培養(yǎng)條件。

1.5.1 IPTG 誘導(dǎo)劑加入量的優(yōu)化

當(dāng)菌液OD600nm為0.6～1.0時(shí)向7個(gè)無(wú)菌小三角瓶中等量分裝一定體積的菌液，然后依次向各瓶中加入IPTG至終濃度為0.01、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0mmol/L?？蛰d對(duì)照(即將pET-28a(+)質(zhì)粒直接轉(zhuǎn)入BL21(DE3)菌株中)加入IPTG 終濃度為1mmol/L。于37℃誘導(dǎo)表達(dá)4h，檢測(cè)蛋白表達(dá)情況。

1.5.2 誘導(dǎo)溫度的優(yōu)化

當(dāng)菌液OD600nm為0.6～1.0時(shí)等量分裝于4個(gè)無(wú)菌三角瓶中，加入0.05mmol/L IPTG，分別于15、20、30、37℃條件下誘導(dǎo)表達(dá)4h 后收集菌體，檢測(cè)蛋白表達(dá)情況。

1.5.3 誘導(dǎo)時(shí)間的優(yōu)化

當(dāng)菌液OD600nm為0.6～1.0時(shí)向6 個(gè)無(wú)菌小三角瓶中等量分裝一定體積的菌液，然后加入IPTG終濃度為0.05mmol/L進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。于37℃誘導(dǎo)6h，每隔1h 取樣檢測(cè)蛋白表達(dá)情況。

1.6 提取包涵體

取3g菌體加入20mL裂解液(50mmol/L Tris-HCl、10mmol/L EDTA、100mmol/L NaCl，pH8.0)，加入溶菌酶至1mg/mL，37℃孵育30min，每隔10min攪動(dòng)一次。冰浴超聲波破碎，功率200～300W，每次10s，間隔10s，共30次。4℃、12000r/min離心20～30min沉淀包涵體，棄上清液。加入30mL洗滌液(50mmol/L Tris-HCl、10mmol/L EDTA、100mmol/L NaCl、0.5% Triton、10mmol/L β-巰基乙醇，pH8.0)超聲波破碎，功率200～300W，每次10s，間隔10s，共10次。于4℃、12000r/min 離心20～30min沉淀包涵體，棄上清液；重復(fù)洗滌兩次；加入20mL尿素洗滌液(100mmol/L Tris-HCl、1mol/L 尿素，pH8.0)再洗滌一次，得到純度較高的包涵體蛋白。用無(wú)菌水洗滌包涵體兩次，凍干，-80℃保存蛋白[9]。

1.7 純化包涵體蛋白

將蛋白溶解于結(jié)合緩沖液 (20mmol/L NaH2PO4、40mmol/L 咪唑、0.5mol/L NaCl、8mol/L尿素，pH8.0)中。His TrapTMFF凝膠柱用10mL雙蒸水洗滌后用10mL結(jié)合緩沖液平衡，之后使目的蛋白與凝膠柱結(jié)合。沒(méi)有結(jié)合的蛋白用洗滌緩沖液(20mmol/L磷酸鈉、100mmol/L咪唑、0.5mol/L NaCl、8mol/L尿素，pH8.0)除去。最后用洗脫緩沖液(20mmol/L磷酸鈉、500mmol/L咪唑、0.5mol/L NaCl、8mol/L尿素，pH8.0) 洗脫，得到目的蛋白[9]。

1.8 復(fù)性重組蛋白

純化后的Cry1C蛋白用透析緩沖液(pH 8.0，50mmol/L Tris-HCl，8、6、4、2、1、0.5、0mol/L尿素)4℃透析。每種尿素濃度需8h透析3次。重新折疊后的Cry1C蛋白在50mmol/L Tris-HCl (pH8.0) 緩沖液中于12000r/min離心15min以去除不溶蛋白。

1.9 SDS-PAGE定量蛋白含量

以牛血清白蛋白(BSA)為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，用Bradford法檢測(cè)樣品中的蛋白含量[10]。將蛋白樣品在上樣緩沖液(50mmol/L Tris-HCl、8% 蔗糖、2% SDS、5%β-巰基乙醇、0.02% 溴酚蘭)中煮沸5min后用SDS-PAGE電泳分離。電泳完畢后用考馬斯亮藍(lán)R-250染色，用脫色液(25%甲醇、10%乙酸)脫色至背景清晰為止。蛋白電泳圖通過(guò)凝膠成像儀進(jìn)行分析。

1.10 三化螟活性實(shí)驗(yàn)

三化螟的飼養(yǎng)方法參照文獻(xiàn)[9]，將包涵體蛋白、純化后蛋白及復(fù)性后蛋白0～17.6μg/g與飼料混合。每個(gè)劑量做3個(gè)平行，每個(gè)試管接20頭三化螟。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cry1C基因密碼子優(yōu)化及克隆

圖2 PCR修改基因、重組質(zhì)粒的酶切鑒定SDS-PAGE電泳圖Fig.2 Agarose gel electrophoresis of PCR products amplified by modified upstream primers and agarose gel electrophoresis for the identification of recombinant plasmid digested with BamHI and Nde I

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)設(shè)計(jì)PCR引物成功的將Cry1C基因中的大腸桿菌稀有密碼子修改成大腸桿菌偏愛(ài)密碼子，最終得到高效表達(dá)。修改后的引物PCR凝膠電泳結(jié)果如圖2所示。將修改后的基因Cry1C-rcp通過(guò)引物加上BamH I和Nde I酶切位點(diǎn)，連入pET-28a(+)質(zhì)粒載體，并轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α中，提取質(zhì)粒經(jīng)PCR酶切鑒定結(jié)果如圖3所示。將鑒定為陽(yáng)性的菌株送上海工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序，結(jié)果顯示，Cry1C基因的全長(zhǎng)1896堿基均無(wú)錯(cuò)配。將測(cè)序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21 (DE3)表達(dá)Cry1C蛋白。

2.2 表達(dá)條件優(yōu)化

圖3 IPTG濃度對(duì)Cry1C重組蛋白表達(dá)影響的SDS-PAGE分析Fig.3 Effect of IPTG concentration on recombinant Cry1C protein expression

從圖3 可以看出，IPTG終濃度對(duì)目的蛋白表達(dá)量影響不大。在低濃度的IPTG誘導(dǎo)條件下(0.05mmol/L)，目的蛋白已經(jīng)有大量表達(dá)，隨著IPTG濃度的增加，蛋白表達(dá)量增加不明顯。

圖4 誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)Cry1C重組蛋白表達(dá)影響的SDS-PAGE分析Fig.4 Effect of induction time on recombinant Cry1C protein expression

從圖4 可以看出，目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)量隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)間達(dá)到4h后目的蛋白的表達(dá)量已經(jīng)趨于穩(wěn)定。有文獻(xiàn)報(bào)道低溫有利于蛋白的可溶性表達(dá)[11]。

本實(shí)驗(yàn)研究了在兩個(gè)較低溫度(15、20℃)及較高溫度(30、37℃)條件下目的蛋白在菌體裂解液的上清液和包涵體中的表達(dá)情況。當(dāng)誘導(dǎo)溫度為15℃或20℃時(shí)，Cry1C目的蛋白有可溶形式表達(dá)；誘導(dǎo)溫度為30℃或37℃時(shí)，目的蛋白幾乎均以包涵體的形式存在。從蛋白表達(dá)的總量上看，37℃時(shí)得到的目的蛋白最多的(圖5)。

圖5 誘導(dǎo)溫度對(duì)Cry1C重組蛋白表達(dá)影響的SDS-PAGE分析Fig.5 Effect of induction temperature on recombinant Cry1C protein

2.3 復(fù)性及純化

將IPTG終濃度為0.05mmol/L、37℃誘導(dǎo)4h的菌體用超聲波破碎后，于12000r/min離心20min，取包涵體沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳，結(jié)果如圖6所示。經(jīng)過(guò)軟件分析得出Cry1C蛋白條帶的灰度占包涵體總蛋白灰度的52.9%，經(jīng)過(guò)3次緩沖液及雙蒸水的洗滌后目的蛋白的純度可達(dá)86.7%，His TrapTMFF凝膠柱純化后的蛋白純度可達(dá)95.6%，透析后蛋白純度沒(méi)有太大變化，為95.8%。

圖6 Cry1C包涵體蛋白純化復(fù)性SDS-PAGE電泳圖Fig.6 SDS-PAGE of purified and refolded Cry1C protein

2.4 蛋白活性鑒定

由表1可見(jiàn)，復(fù)性后的蛋白表現(xiàn)出較高的殺蟲(chóng)活性，按1.10節(jié)的方法測(cè)定其殺蟲(chóng)活力，其LD50為4.99μg/g。包涵體蛋白和純化后蛋白的LD50分別為8.36μg/g和 6.99μg/g。這表明本實(shí)驗(yàn)的蛋白純化和復(fù)性方法能有效地純化Cry1C蛋白和恢復(fù)其活性。

表1 Cry1C蛋白三化螟殺蟲(chóng)活性Table 1 Killing activity of different forms of Cry1C toxin against yellowstemborer

3 討 論

圖7 稀有密碼子修改前后Cry1C蛋白表達(dá)電泳圖Fig.7 SDS-PAGE of Cry1C protein encoded by unmodified and modified rare condons

基因工程技術(shù)中影響外源基因在工程菌中表達(dá)效率的因素主要包括控制外源基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子強(qiáng)弱、核糖體結(jié)合位點(diǎn)與起始密碼子ATG之間的距離、外源基因的密碼子在宿主細(xì)胞中的使用頻率等。其中遺傳密碼子的偏性被認(rèn)為是最為重要的影響因素。大腸桿菌和真核生物相比，其氨基酸密碼子的使用頻率不同，存在著一個(gè)明顯的傾向性，并且細(xì)胞內(nèi)對(duì)應(yīng)的 tRNA 量與密碼子的使用頻率成正比。常用密碼子(majar codon)是指那些在高表達(dá)基因中出現(xiàn)的密碼子，而稀有密碼子(rare codon)是指那些低水平表達(dá)的基因中出現(xiàn)的密碼子，當(dāng)E. coli高表達(dá)外源蛋白時(shí)，如果信息密碼子的分配情況與E. coli相似，則細(xì)胞能正常進(jìn)行 tRNA的乙酰化和蛋白翻譯，減少翻譯錯(cuò)誤出現(xiàn)的頻率，反之如果信使RNA帶有稀有密碼子，則蛋白質(zhì)的翻譯會(huì)出現(xiàn)障礙，影響基因的表達(dá)水平，在E. coli的mRNA中，AGG/ AGA出現(xiàn)的頻率較低，分別近似為 0.14%和 0.21%，它們對(duì)外源蛋白表達(dá)的影響是近年來(lái)關(guān)于稀有密碼子研究的熱點(diǎn)之一[12]。另外有文獻(xiàn)報(bào)道稀有密碼子的位置要比它的頻率更能影響蛋白表達(dá)。在5＇端25個(gè)堿基內(nèi)的稀有密碼子會(huì)影響蛋白表達(dá)[13-15]。本實(shí)驗(yàn)正是通過(guò)修改前86個(gè)堿基中的稀有密碼子以實(shí)現(xiàn)在大腸桿菌中的穩(wěn)定、高效表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)也嘗試了常規(guī)表達(dá)方法(圖7)，但是未見(jiàn)外源蛋白表達(dá)。另外，本實(shí)驗(yàn)還應(yīng)用了BL21 (DE3)-CodonPlus進(jìn)行表達(dá)，但是表達(dá)情況并無(wú)明顯改善。

實(shí)質(zhì)等同性原則注重于轉(zhuǎn)基因植物與傳統(tǒng)對(duì)比物差異的評(píng)價(jià)，轉(zhuǎn)基因植物外源基因表達(dá)蛋白的安全性評(píng)價(jià)是現(xiàn)階段轉(zhuǎn)基因植物商品化的主要技術(shù)問(wèn)題之一。目前的分離技術(shù)尚不能從轉(zhuǎn)基因植物中分離純化出足夠用于安全性評(píng)價(jià)的表達(dá)蛋白質(zhì)產(chǎn)物，因此，可以用外源表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生目的蛋白質(zhì)。凡是以微生物表達(dá)的蛋白代替轉(zhuǎn)基因植物中的目的蛋白，需要證實(shí)其與植物中的蛋白具有實(shí)質(zhì)等同性方可使用。本實(shí)驗(yàn)在生物活性方面證實(shí)了兩種蛋白的等同性。大腸桿菌表達(dá)的蛋白與植物蛋白在SDS-PAGE凝膠上大致處于同一位置，分子質(zhì)量相近，生物活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)大腸桿菌BL21(DE3)表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生的目的蛋白與轉(zhuǎn)基因植物中的目的蛋白基本是等同的，可以用于后續(xù)的食用安全性評(píng)價(jià)。

本實(shí)驗(yàn)實(shí)現(xiàn)了CryC蛋白的大腸桿菌表達(dá)、純化及復(fù)性，并證實(shí)了該蛋白與水稻中該蛋白的實(shí)質(zhì)等同性。CryC蛋白不僅能夠用來(lái)代替水稻中的該蛋白來(lái)進(jìn)行轉(zhuǎn)基因作物的食用安全性評(píng)價(jià)，還能作為抗原制作抗體，實(shí)現(xiàn)CryC蛋白快速檢測(cè)。另外通過(guò)大規(guī)模發(fā)酵還能生產(chǎn)生物農(nóng)藥，從而降低化學(xué)農(nóng)藥的使用，減少環(huán)境污染。

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Expression in E. coli, Purification and Refolding of Recombinant Cry1C Gene from Bacillus thuringiensis

CAO Si-shuo1，XU Wen-tao1,2，RAN Wen-jun1，LIANG Li-xing1，HE Xiao-yun2，LUO Yun-bo1，YUAN Yan-fang2，HUANG Kun-lun1,2,*
(1. College of Food Science and Nutrition Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China；2. Supervision, Inspection and Testing Center of Genetically Modified Food Safety, Ministry of Agriculture, Beijing 100083, China)

The Cry1C gene from Bacillus thuringiensis (Bt) was cloned by polymerase chain reaction (PCR). Due to a large number of E. coli low-usage codons in the gene, the first 86 bases were optimized by PCR to improve the expression in E. coli. Cry1C protein was highly expressed in E. coli BL21 as inclusion bodies, which can be dissolved in 8 mol/L urea and purified by His TrapTMFF crude column under denaturing conditions. The purified Cry1C protein was dialyzed against the refolding buffer to obtain a soluble and biologically active protein. Finally, the protein was determined to be 99.2% purity.

Cry1C protein；rare codon；inclusion body；expression；purification；refolding

Q344.13

A

1002-6630(2011)07-0211-05

2010-06-02

農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因生物重大專項(xiàng)(2008ZX08011-005；2009ZX08011-001B)

曹思碩(1984—)，女，博士研究生，研究方向?yàn)槭称钒踩-mail：cauxwt@yahoo.cn

*通信作者：黃昆侖(1968—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称钒踩?。E-mail：hkl009@163.com