韋漢昌 ，韋善清 ，何建華

（1.廣西師范大學(xué)，廣西 桂林 541004；2.廣西大學(xué)，廣西 南寧 530004；3.南寧地區(qū)教育學(xué)院，廣西 南寧 530001）

動物蛋白的提取普遍采用單一酶水解法，但單一酶的剪切范圍小，水解度不高，所得的酶解產(chǎn)物多為多肽，分子量亦較大［1］。本試驗以水解牛骨蛋白為對象，研究動物蛋白水解復(fù)合酶的配制，以期提高動物蛋白的溶出率。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

新鮮牛肋骨，動物瘦肉（市售）；木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、風(fēng)味酶（10 萬 U·g-1）；胃蛋白酶（25萬 U·g-1）；碳酸鈉、氯化鈉、氫氧化鈉、鹽酸、硫酸銅、硫酸鉀、硫酸、硼酸等 （AR）。

1.2 主要儀器設(shè)備

PHS-3C pH計 ，KDT-1000全自動定氮儀，RE201C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，F(xiàn)W-100高速萬能粉碎機(jī)，TD5A-WS離心機(jī)，DZKW-4電子恒溫水浴鍋。

1.3 方法

1.3.1 牛骨粉的制備及酶解方法

用切割機(jī)將新鮮牛肋骨切割成長度為3～5cm的骨塊，清水洗凈牛骨塊，剔除非骨成分。牛骨塊置于鍋中，以蒸餾水剛好浸沒為宜，微沸1h，除去殘血，取出脫脂；高壓蒸煮3～4h至牛骨軟化并與肉、脂分離，即可出鍋。用雙層紗布過濾，濾液冷至10℃除去脂肪后可用于制備骨汁粉。骨塊65℃恒溫干燥24h后進(jìn)行粗粉碎、細(xì)粉碎，過0.098mm篩。細(xì)粉碎時加入適量的環(huán)狀糊精以消除制品的腥躁氣味。

酶解牛骨蛋白時，首先將牛骨粉和水按一定的料液比混合，浸泡6h，然后在設(shè)計的酶用量、溫度、p H值及酶解時間等條件下進(jìn)行酶解。

1.3.2 復(fù)合酶篩選方法

以胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶及風(fēng)味酶等幾種經(jīng)濟(jì)、常用的蛋白水解酶作為篩選對象，綜合酶剪切特性、酶解溫度、酶解p H值、蛋白質(zhì)溶出率及水解液感觀等因素對它們進(jìn)行篩選，選擇中性蛋白酶、胰蛋白酶、風(fēng)味酶作為復(fù)合酶組分，并通過考察組分比例對蛋白溶出率的影響，篩選復(fù)合酶各組分的比例，最后采用四因素三水平正交試驗優(yōu)化蛋白提取工藝條件。

1.3.3 蛋白質(zhì)測定方法

各試樣蛋白質(zhì)含量的測定方法及提取液中蛋白質(zhì)濃度的測定方法參照國標(biāo)GB／T 5009.5-2003，采用凱氏定氮法測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 各試樣蛋白質(zhì)含量測定結(jié)果

參照國標(biāo) GB／T 5009.5-2003采用凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)的含量，測定結(jié)果見表1。

表1 各試樣蛋白質(zhì)含量測定結(jié)果Table 1 Detection result of protein content from different samples

2.2 復(fù)合酶組分的篩選

胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、風(fēng)味酶等常用蛋白酶剪切傾向性、適宜酶解溫度、適宜酶解p H值及水解牛骨蛋白蛋白效果見表 2［3~4］，其中的蛋白溶出率在酶用量 4000 U·g－1（原料質(zhì)量）、料液比 1∶6（質(zhì)量比）、水解時間 5h 及各種酶的適宜酶解溫度、適宜酶解p H值等條件下進(jìn)行測定。

表2 各種酶水解特性及水解效果Table 2 Specificities and hydrolysis effect of different proteases

從表2看出，使用胃蛋白酶進(jìn)行酶解時蛋白質(zhì)溶出率較高，但其水解溫度與其他酶的水解溫度相差較大，而且酸堿度須控制在pH＝2.0左右，易對氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)造成破壞，酶解液渾濁、苦味，并含有大量鹽分，需增加脫鹽工藝和設(shè)備，給生產(chǎn)造成不便。木瓜蛋白酶來自植物，水解動物蛋白的能力較弱，水解度最低；風(fēng)味酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶三者水解溫度、水解p H值接近，蛋白溶出率較高，水解液無苦味或苦味弱，含鹽量低，因此本試驗選擇風(fēng)味酶、中性蛋白酶及胰蛋白酶作為復(fù)合酶組分。

此復(fù)合酶在水解過程中水解液pH能從起始設(shè)定的7.5自動降至6.5左右，能充分發(fā)揮組分酶的最大活性，剪切范圍寬，有利于提高水解度；水解完成后將溶提液溫度升高到130~140℃，恒溫1h進(jìn)行Maillard反應(yīng)后，所得的水解蛋白質(zhì)能保持原有的天然香氣和味道。

2.3 復(fù)合酶組分配比篩選

在料液比1∶6、水解溫度55℃及水解時間5h等條件下，以酶總用量4000 U·g-1為基準(zhǔn)，調(diào)節(jié)風(fēng)味酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶配比，考察蛋白質(zhì)溶出率。試驗結(jié)果見表3。

表3 酶配比對牛骨蛋白溶出率的影響Table 3 Effect of proteases proportion on extraction ratio of protein from ox bone

試驗結(jié)果表明，試驗3牛骨蛋白溶出率最高，因此，按酶活性計算，復(fù)合酶組分配比確定為胰蛋白酶、中性蛋白酶、風(fēng)味酶的用量比例為1∶3∶2。

2.4 酶解條件優(yōu)化

在起始水解p H＝7.5條件下，以復(fù)合酶用量、料液比、酶解溫度及酶解時間作為考察因素，各取三個水平，以牛骨蛋白溶出率為考察指標(biāo)，按L9（34）正交表進(jìn)行試驗設(shè)計，優(yōu)化提取條件。水平取值、試驗結(jié)果、極差分析及方差分析結(jié)果分別見表 4、表 5。

表4 正交試驗及極差分析Table 4 Orthogonal experiment and range analysis

表5 方差分析結(jié)果Table 5 Result of variance analysis

從表4、表5看出，極差分析結(jié)果與方差分析結(jié)果無明顯差異，四因素影響顯著性為A＞B＞D＞C，最佳提取工藝條件為A2B1C2D3，即在起始水解 pH＝7.5 條件下，復(fù)合酶用量 4000 U·g－1，料液比1∶4，酶解溫度55℃，酶解時間6h。在此條件下，牛骨蛋白溶出率67.7%。

2.5 復(fù)合酶適應(yīng)性試驗

表6為復(fù)合酶及酶解能力較強(qiáng)的中性蛋白酶水解各種動物蛋白試驗結(jié)果。試驗條件為料液比 1∶4、酶用量 4000 U·g－1、酶解時間 6h、酶解溫度55℃，復(fù)合酶酶解起始pH值7.5，中性蛋白酶酶解 pH 值 7.0。

試驗結(jié)果顯示，復(fù)合酶水解各類動物蛋白的能力強(qiáng)于單一酶，可適用于各類動物蛋白質(zhì)的提取。

表6 復(fù)合酶適應(yīng)性試驗結(jié)果Table 6 The experiments of adaptability for multienzymecomplex

3 結(jié)論

風(fēng)味酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶等組成的復(fù)合酶水解動物蛋白的效果比單一酶的水解效果更好，對各種動物蛋白的水解具有較好的適應(yīng)性。

［1］ 房新平，生慶海，王玉良，等.酶法水解牛胎盤下腳料［J］.中國乳品工業(yè)， 2005， 33（3）：35-53.

［2］ ALDER-NISSEN J.Enzymatic hydrolysis of food protein［M］.London： Elsevier Applied Science Publishers Ltd，1986： 25-40.

［3］ 吳敏，尹彥洋，羅愛平，等.雙酶分步水解牛骨蛋白工藝的優(yōu)化［J］.食品科學(xué)，2009，30（20）：223-226.

［4］ 張帥，黃志明，梁巧榮.雙酶法酶解文慶鯉蛋白的研究［J］.現(xiàn)代食品科技， 2006，23（2）： 59-61.