劉 瑩，孟慶妍，翟宏宇

(吉林省食品藥品檢驗(yàn)所，吉林 長春 130033)

復(fù)方苦參腸炎康片是由苦參、黃連等8味中藥材及提取物組成的復(fù)方制劑,具有清熱燥濕止瀉的作用。用于濕熱泄瀉。近年來采用高效液相色譜法文獻(xiàn)較少，且多為采用C18色譜柱測定其中苦參堿單一成分[1-2]或采用氨基色譜柱同時(shí)測定苦參堿和氧化苦參堿，極少見采用C18色譜柱同時(shí)測定苦參堿和氧化苦參堿的報(bào)道。本文參考文獻(xiàn)方法[3]的流動(dòng)相，選擇并優(yōu)化色譜條件，建立一種采用反相高效液相色譜法使用C18色譜柱同時(shí)測定該復(fù)方制劑中苦參堿和氧化苦參堿的含量的方法。

1 儀器與試藥

Agilent 1100高效液相色譜儀(包括四元泵、在線真空脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、紫外檢測器、Agilent色譜工作站)，AE-160型電子分析天平(METTLER TOLEDO)(十萬分之一)，AG-135型電子分析天平(METTLER TOLEDO)(百萬分之一)，KQ-500E超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。 對(duì)照品苦參堿(批號(hào)110805-200306)和氧化苦參堿(批號(hào)110780-200506)(均為含量測定用)購自中國藥品生物制品檢定所；甲醇為色譜純，磷酸為色譜純。其他試劑為分析純。水為超純水。 復(fù)方苦參腸炎康片(規(guī)格：片芯重0.4 g，通化東寶藥業(yè)股份有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱取苦參堿對(duì)照品21.95 mg、氧化苦參堿對(duì)照品12.0 mg，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取混合對(duì)照品溶液5 mL，置25 mL量瓶中，加入氯仿10 mL，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2 供試品溶液制備 取本品20片，除去糖衣，精密稱定，研細(xì)，取約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入三氯甲烷50 mL、濃氨試液2 mL，密塞，稱定重量，輕輕搖勻，超聲處理(功率500 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，再稱定重量，用三氯甲烷補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液10 mL，轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3 陰性樣品溶液的制備 取缺苦參的陰性樣品，同“2.2”項(xiàng)下方法操作，制得陰性樣品溶液。

2.4 色譜條件 色譜柱：Gemini-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流動(dòng)相：甲醇-磷酸鹽緩沖液(將磷酸二氫鉀3.402 g溶解于1 000 mL水中，用磷酸調(diào)結(jié)至pH 3.0)(7∶93)；流速：0.8 mL/min；檢測波長：220 nm；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量5 μL。在上述色譜條件下，苦參堿與氧化苦參堿的保留時(shí)間分別為10.330 min和20.438 min，二者的分離度為20.4。

2.5 線性關(guān)系考察 分別精密吸取對(duì)照品溶液1、3、5、10、15、20 μL，注入液相色譜儀，測定峰面積，以進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo),峰面積值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，苦參堿和氧化苦參堿的回歸方程分別為Y=794.09X+7.38r=1.000 0Y=765.23X+0.36r=1.000 0。結(jié)果表明：苦參堿進(jìn)樣量在0.175 6～3.512 μg，氧化苦參堿進(jìn)樣量在0.103 84～2.076 8 μg范圍內(nèi),與峰面積具有良好的線性關(guān)系。

2.6 精密度試驗(yàn) 取同一供試品溶液，按上述色譜條件，重復(fù)進(jìn)樣6次，測定峰面積。結(jié)果苦參堿和氧化苦參堿峰面積的RSD(n=6)分別為0.64%，0.05%。表明精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別在 0、2、8、18、30 h測定，苦參堿和氧化苦參堿峰面積的 RSD (n= 5)分別為0.43%和0.59% 。說明供試品溶液在 28 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批號(hào)的復(fù)方苦參腸炎康片(批號(hào)070302)2 g，共6分，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下進(jìn)行測定。結(jié)果苦參堿和氧化苦參堿含量平均值(n=6)分別為4.0 mg/g，4.9 mg/g，RSD分別為2.33%和1.76%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.9 回收率試驗(yàn) 精密稱取已測知含量的復(fù)方苦參腸炎康片(批號(hào)070302)粉末分，每分1 g，每分精密加入含苦參堿0.183 52 mg/mL和氧化苦參堿0.195 66 mg/mL的混合對(duì)照品的三氯甲烷溶液50 mL，按“2.2”項(xiàng)下的方法制備所需溶液，在上述色譜條件下進(jìn)行分析測定，計(jì)算回收率。結(jié)果苦參堿和氧化苦參堿的平均回收率(n=6)分別為96.64%和99.88%，RSD分別為1.3%和2.7%。

2.10 樣品測定 分別取不同批次的復(fù)方苦參腸炎康片，按“2.2”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液。精密吸取供試品溶液5 μL，在上述色譜條件下進(jìn)行分析，測定峰面積，用外標(biāo)法計(jì)算出苦參堿和氧化苦參堿的含量，結(jié)果3批樣品中苦參堿的含量分別為8.0，4.0，6.2 mg/片；氧化苦參堿的含量分別為2.0，4.8，2.3 mg/片。

3 討論

3.1 檢測波長的選擇 分別對(duì)苦參堿和氧化苦參堿進(jìn)行光譜掃描，根據(jù)掃描結(jié)果，并參考2005年版中國藥典中苦參含量測定項(xiàng)下的檢測波長[1]，故選擇220 nm為測定波長。

3.2 供試品制備方法的選擇 分別采用樣品用濃氨試液-氯仿超聲、濃氨試液-甲醇超聲、鹽酸-甲醇超聲。結(jié)果表明使用鹽酸-甲醇超聲雜質(zhì)過多，無法進(jìn)行分析；濃氨試液-甲醇超聲提取含量最高，但是雜質(zhì)較多，無法達(dá)到基線分離；濃氨試液-氯仿超聲，提取含量較高，雜質(zhì)少，樣品分離度好，故選用濃氨試液-氯仿為提取溶劑。

樣品由濃氨試液-氯仿超聲提取后的濾液無法直接注入高效液相色譜儀進(jìn)行分析，故需要進(jìn)一步處理。分別采用將一定量濾液蒸干后用甲醇溶解，加磷酸鹽緩沖液稀釋、取一定量的濾液直接用甲醇稀釋。結(jié)果表明濾液蒸干后用溶劑定容的樣品苦參堿和氧化苦參堿的含量均有所下降，表明上述2種生物堿不穩(wěn)定，蒸干對(duì)含量有影響。故采用將濾液直接用甲醇稀釋的方法制備供試品溶液。

3.3 3批樣品的測定 經(jīng)過對(duì)3批樣品的測定，試驗(yàn)結(jié)果表明各批樣品苦參堿和氧化苦參堿含量差別較大，但是二者和差別并不大，所以用二者的和控制復(fù)方苦參腸炎康片的質(zhì)量更加合理。

3.4 色譜柱的考察 中國藥典2005版一部中藥材“苦參”【含量測定】項(xiàng)下采用氨基鍵合硅膠為填充劑的色譜柱同時(shí)測定苦參堿和氧化苦參堿[1]，氨基鍵合硅膠柱較少應(yīng)用，推廣起來受一定限制，并且試驗(yàn)結(jié)果表明使用氨基鍵合硅膠柱出峰較快，難于分離成分復(fù)雜樣品。故本文建立了一種全新的采用普通C18柱同時(shí)測定處方中苦參堿和氧化苦參堿的方法。

3.5 分離條件的選擇 采用C18色譜柱比較不同的流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸溶液(三乙胺調(diào)pH值至8.0)、乙腈-磷酸鹽緩沖液(pH 6.8)-三乙胺、甲醇-磷酸鹽緩沖液(pH 3.0)。結(jié)果表明以甲醇-磷酸鹽緩沖液(pH 3.0)平衡時(shí)間短，分離效果佳，該流動(dòng)相可使苦參堿和氧化苦參堿均能達(dá)到基線分離。

3.6 進(jìn)樣量的選擇 由于供試品溶液的極性和流動(dòng)相的極性相差較大，進(jìn)樣量過大會(huì)導(dǎo)致峰型不佳，出現(xiàn)峰變寬甚至分裂，進(jìn)樣量過小有可能導(dǎo)致進(jìn)樣不準(zhǔn)確，所以進(jìn)樣量定為5 μL較合適。

[1]蔣珍藕.苦參堿的提取工藝及測定方法的研究進(jìn)展[J].中醫(yī)藥導(dǎo)報(bào),2005,11(8):90.

[2]葉秀金,宋粉云.HPLC法測定清肺抑火丸中苦參堿和氧化苦參堿的含量[J].中國藥房,2011(12):1127-1129.

[3]羅德啟攵.高效液相色譜法測定癢灌洗劑中苦參堿和氧化苦參堿的含量[J].醫(yī)藥導(dǎo)報(bào),2011(1):103-104.

[4]樓文斌,徐艷艷.治傷軟膏中苦參堿的含量測定[J].齊魯藥事,2009(9):531-533.