陶金程,漢麗梅,劉 佳,于天明

(沈陽農(nóng)業(yè)大學,遼寧沈陽110866)

腫瘤是機體在各種致癌因素作用下,局部組織的某一個細胞在基因水平上失去對其生長的正常調(diào)控,導致其克隆性異常增生而形成的新生物,腫瘤的發(fā)生是多階段、多步驟的復(fù)雜過程。近年來,人們注意到幾乎所有的癌基因、抑癌基因都直接或間接地參與了細胞周期的調(diào)控,有的其本身就是細胞周期調(diào)控的主要成分,它們的異常表達可導致細胞周期調(diào)節(jié)失控,p27蛋白是新近發(fā)現(xiàn)的CDKI家族成員之一,是一類重要的細胞周期調(diào)控蛋白,目前已成為腫瘤研究的一個熱點。端粒酶是一種核糖蛋白酶,具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性,能以端粒酶RNA(hTR)為模板,向染色體末端添加T2AG3序列,端粒酶對腫瘤細胞獲得無限增殖特性進而成為永生化細胞起了重要作用。文章針對p27,p27與腫瘤、端粒酶的關(guān)系進行了綜述。

1 p27 Kip1概述

1.1 p27 Kip1基因

Polyak K等在轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming grow th factor-β,TGF-β)和經(jīng)細胞接觸處理的生長抑制細胞中發(fā)現(xiàn)了一種相對分子質(zhì)量為27 000的熱穩(wěn)定蛋白。這種物質(zhì)在體外與細胞周期蛋白ECDK2和細胞周期蛋白D-CDK4緊密結(jié)合,并以一種化學劑量的關(guān)系抑制細胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin dependent kinases,CDKs)的活性,因此被稱為p27 Kip1(p27或kip1)。p27基因定位于人體12號染色體的12p12.0～12p13.1交界處。含有兩個參與編碼的外顯子,能編碼一個198氨基酸的多肽。真核生物細胞周期失控是細胞增殖過度及癌變的重要原因,在細胞周期中有3個調(diào)控點,這3個調(diào)控點分別是G0-G1、G1-S、G2-M,其中G1-S期和G2-M期最為重要,細胞一旦通過G1-S1期,它就進入DNA合成期,如果DNA受到損傷且未得到正確修復(fù),細胞就不能通過G2-M期。參與細胞周期調(diào)控的主要分子有,細胞周期蛋白(cyclin)、CDKs和CDK抑制蛋白(cyclin dependent kinase inhibitors,CDKI)。其中CDKI按照結(jié)構(gòu)和功能的不同分成兩大類,一類是Ink4(inhibitor of cdk4),包括p15、p16、p18、pl9;另一類是Cip/Kip(CDK-interacting protein/kinase inhibition protein),包括p21Cip-1、p27Kip-1和p53 Kip-2。CDKI是近幾年來分離得到的一類重要的細胞周期調(diào)控蛋白,參與細胞G1期進入S期的負調(diào)控,可防止細胞過度增殖和惡變。p27基因?qū)儆贑DKI家族成員之一[1],通過多種方式參與細胞周期調(diào)控,最終抑制細胞的分裂和增殖,促進細胞的分化和凋亡。

1.2 p27 Kip1蛋白

Toyoshima H等用酵母雙雜交系統(tǒng),在研究與cyclinD-CDK4相互作用的蛋白時,克隆了鼠的p27cDNA,其片段長茺為591 bp,蛋白由197個氨基酸組成。人的p27cDNA長為594 bp,其蛋白由198個氨基酸組成。研究發(fā)現(xiàn),p27是高度保守的蛋白分子,在鼠、貂中p27蛋白的氨基酸順序非常相似,有90%的同源性。p27蛋白的有序結(jié)構(gòu)剛性卷曲、β-發(fā)夾和β-鉸鏈等疏水性殘基在形成cyclin-CDK2-p27三元復(fù)合物時的分子間接觸中起重要作用。β-鉸鏈在主鏈間形成的6個氫鍵及310-螺旋插入到CDK2的催化集團能穩(wěn)定三元復(fù)合物的結(jié)構(gòu)。Mont法模顯示p27蛋白β-發(fā)夾和β-鉸鏈二級機關(guān)形成的天然分子間界面是形成三元復(fù)合物快速動力學轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵[2]。Verkhivker C M等[3]曾通過改變退火溫度研究了分子間作用對p27三元復(fù)合物結(jié)構(gòu)預(yù)測的影響。p27蛋白通過化學計量方式與CDK或cyclin/CDK復(fù)合物結(jié)合,抑制cyclin/CDK復(fù)合物的活性,阻止細胞周期中G1到S期的轉(zhuǎn)換,使細胞周期停滯于G1期,抑制細胞增殖,促進介導細胞間黏附及誘導凋亡[4]。p27蛋白通過N-末端與cyclin/CDK復(fù)合物結(jié)合,阻斷了cyclin/CDK復(fù)合物和ATP結(jié)合,導致CDK裂解,最終抑制了cyclin/CDK的活性[5]。通過轉(zhuǎn)錄、翻譯及翻譯后調(diào)節(jié)p27蛋白表達水平是調(diào)控p27抑制功能發(fā)揮的主要機制[6]。p27活性調(diào)節(jié)一個主要機制是磷酸化,其具有多個酪氨酸、絲氨酸、或蘇氨酸的磷酸化位點。p27對cyclin/CDK復(fù)合物活性的抑制作用比較弱,其實現(xiàn)是通過相關(guān)蛋白磷酸化[8-9]。

2 p27 Kip1與腫瘤

p27可以以多種方式參與細胞周期調(diào)控,最終抑制細胞分裂和增殖,促進細胞分化和凋亡,因此,它與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、診斷及治療均存在密切的關(guān)系。

2.1 p27 Kip1基因在腫瘤中的研究

p27蛋白是一種非常規(guī)的抑癌因子,因為它的基因突變在腫瘤中非常罕見,這意味著在腫瘤的發(fā)展中蛋白質(zhì)的正常功能被破壞[10]。同時細胞周期各時相中p27mRNA水平無明顯改變,而p27蛋白的表達卻體現(xiàn)出時相特異性,其表達水平在GO期細胞中最高,S期其表達水平下降,當細胞內(nèi)DNA合成達到高峰時,降至最低,提示p27蛋白表達的改變可能是翻譯或翻譯后水平的調(diào)節(jié)的結(jié)果。p27基因與腫瘤的關(guān)系則主要體現(xiàn)于p27蛋白水平而非基因水平的改變[11]。Kawamata N等運用Southern雜交和聚合酶鏈反應(yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性(PCR-SSCP)技術(shù)檢測432例多種(包括胃癌、卵巢癌、肺癌、子宮內(nèi)膜癌等)惡性腫瘤和20株癌細胞株中的p27基因突變,僅發(fā)現(xiàn)l例第109位密碼子的多態(tài)性和l例靜止突變,其余均無基因突變、缺失和重排等異常。

2.2 p27 Kip1蛋白在腫瘤的表達及臨床意義

在細胞周期調(diào)控機制中,p27是最關(guān)鍵的抑制因子之一,幾乎可以抑制所有的CDK和cyclin復(fù)合物激酶活性[12],它是一個不僅能調(diào)控細胞周期還能抑制細胞分裂的重要因子[13],在細胞增殖、細胞分化以及細胞凋亡等過程中都起著非常重要的作用。越來越多的證據(jù)表明p27蛋白可能成為多種人類腫瘤的獨立預(yù)后因子和未來腫瘤治療的新靶點[14]。研究表明,p27基因在靜止細胞內(nèi)含量較高,而在增殖細胞內(nèi)其含量非常低,因此認為p27蛋白表達水平及活性改變與腫瘤的形成及預(yù)后有關(guān),p27的錯誤調(diào)節(jié)導致其失活及降解增加,與癌癥的發(fā)展相關(guān)[15-16]。目前研究發(fā)現(xiàn),多數(shù)婦科腫瘤都存在p27蛋白表達異常,且影響某些疾病的預(yù)后[17]。吳芃等[18]研究發(fā)現(xiàn)p27蛋白主要在細胞核中表達,腎癌組表達率明顯低于正常組(P＜0.05),且在腫瘤不同的臨床分期及病理分級間的表達有顯著差異(P＜0.05);p27mRNA的表達在正常組織和腎癌組織中無明顯差異,表明p27的表達調(diào)控可能是基于翻譯階段的蛋白降解,p27低表達可能促進腫瘤的演進與發(fā)展。鄧榮輝等[19]用免疫組化的方法研究乳腺癌中p27表達表明,60例正常乳腺組織與乳腺癌組織中p27高表達率相比,兩者差異有統(tǒng)計學意義。乳腺癌組織中p27高表達與腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移有關(guān),與正常乳腺組織相比,p27的表達降低與乳腺癌的發(fā)生有明顯關(guān)系。魏茂富等[20]采用免疫組化方法,分別檢測20例正常大腸黏膜、22例大腸腺瘤和69例大腸癌中p27蛋白表達情況,高、中和低分化大腸腺癌組織中陽性表達率分別是100.00%、88.24%和31.91%,統(tǒng)計學分析表明高分化腺癌與中分化腺癌相比差異沒有統(tǒng)計學意義(P=1.000),而兩者與低分化腺癌相比差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),表明P27的表達與腫瘤分化程度呈負相關(guān),而與臨床其他病理因素均無相關(guān)性(P＞0.05),故p27蛋白檢測可作為評價大腸癌惡性程度的重要指標。膀胱移行細胞癌(bladder transitional cell carcinoma,BTCC)是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤,具有生長緩慢、多中心性、易復(fù)發(fā)等臨床特點,李朝爭等[21]證實p27在膀胱移行細胞癌組織中表達陽性率明顯低于正常黏膜組織,p27在BTCC中表達水平與腫瘤病理分級、臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等均顯著相關(guān)。p27陽性表達隨惡性程度增加而降低,提示p27與BTCC發(fā)生發(fā)展有關(guān),可能抑制腫瘤的惡性表型,抑制腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移。還如外源性p27基因可作為目的基因用于腫瘤的基因治療,在這方面也有相關(guān)報道,如將外源性p27基因?qū)胄切文z質(zhì)瘤細胞,可使外源性p27基因在這些腫瘤細胞內(nèi)高表達,明顯抑制腫瘤的生長。

3 p27 Kip1與端粒酶

端粒酶活性與細胞周期調(diào)控之間的關(guān)系尚不十分清楚,但有研究表明端粒酶活性與細胞周期調(diào)控密切相關(guān)。通過研究證實在細胞周期的不同時期端粒酶的活性不同,阻滯于G1/S期的腫瘤細胞中端粒酶活性與非同步培養(yǎng)物中活性水平相仿[16];通過S期時端粒酶活性增高,S期細胞可檢出最高水平的端粒酶活性;而在G2/M期幾乎檢測不到端粒酶活性,這些試驗結(jié)果建立了端粒酶和細胞周期運行間的細胞周期依賴性調(diào)節(jié)的關(guān)系。p27作為一種非特異性的多功能CDKI,通過多種方式對細胞周期進行負性調(diào)控,從而使細胞停滯于G1期,抑制了細胞的生長增殖,其主要功能是抑制G1期復(fù)合物cyclin-CDK的活性,阻止細胞周期G1/S轉(zhuǎn)化,從而抑制細胞增殖[22]。Kondo S等認為p27蛋白的表達與端粒酶活性可能有聯(lián)系。細胞周期依賴性激酶抑制劑p27是細胞周期G1期限制性位點的調(diào)控因子[23],而端粒酶活性的表達是惡性腫瘤細胞無限增殖的分子基礎(chǔ),抑制細胞端粒酶活性,將導致細胞端粒變短并激活細胞衰老途徑[24]。p27蛋白作為CDK抑制劑(CKI)CIP/KIPI家族成員之一能與各種CDK復(fù)合物、周期蛋白A、E、D1、D2和D3都能相互作用,并引起細胞生長停止于Gl期;而端粒酶在細胞周期G1期活性明顯升高、S期達到高峰。端粒酶與p27蛋白間確切的相互作用機制還有待進一步研究。

4 展望

p27基因作為一種新的腫瘤候選抑制基因正越來越引起人們的研究興趣,但對于p27作用的機制目前還知之甚少,甚至可能還有很多功能沒有被發(fā)現(xiàn)。對p27進行修飾后能否起到更有效的腫瘤治療效果,其對于某些腫瘤的預(yù)后和指導治療作用能否真正用于臨床。此外端粒酶活性與p27在細胞周期調(diào)控之間的關(guān)系,兩者在細胞衰老中到底有何作用,以及在腫瘤發(fā)生、發(fā)展和治療方面的作用,有待進一步研究。相信隨著分子生物學的發(fā)展,這些問題都將獲得圓滿解決。

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