包亞妮，董建青，袁 芳

(中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京 100083)

超臨界CO2萃取工藝條件對梔子油脂肪酸組成及其抗氧化活性的影響

包亞妮，董建青，袁 芳*

(中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京 100083)

利用氣相色譜(GC)測定梔子油脂肪酸組成。結(jié)果顯示梔子油中主要含有5種脂肪酸，即亞油酸、油酸、棕櫚酸、硬脂酸和亞麻酸。在萃取壓力30MPa、溫度55℃、CO2流速15kg/h條件下分別占44.38%、24.96%、24.83%、2.55%、1.31%。萃取壓力、溫度、CO2流速對其脂肪酸組成具有一定的影響，但不顯著。通過清除DPPH和ABTS自由基，得出梔子油具有一定的抗氧化活性。不同萃取壓力、溫度、CO2流速對梔子油清除DPPH和ABTS自由基的能力具有不同程度的影響。

梔子油；超臨界CO2；脂肪酸組成；抗氧化性

梔子為茜草科植物梔子(Gardenia jasminoides Ellis)的干燥成熟果實。據(jù)《本草綱目》等記載，梔子性寒味苦，無毒，具有瀉火解毒、清熱利濕、涼血散淤等作用[1]。目前，關(guān)于梔子中的色素[2-3]、黃酮類[4-5]、梔子甙[6-7]等方面的研究報道較多，而關(guān)于梔子油的研究卻較為少見。

不飽和脂肪酸是人體必需的脂肪酸，具有能降低血液中的膽固醇和甘油三酯含量，增強細胞膜通透性，阻止心肌組織和動脈硬化，改善血液微循環(huán)，提高腦細胞活性等功能[8]。梔子油中含有較多的不飽和脂肪酸，研究超臨界CO2工藝條件對梔子油脂肪酸組成及含量的影響還未見報道，故本研究能為更有效地利用梔子資源提供一定的理論依據(jù)和參考。

隨著人們生活水平的提高，消費者對食品的生理保健作用越來越重視，特別是食品的抗氧化功能?？寡趸镔|(zhì)可以抵御自由基對人體的侵害，緩解由自由基引起的一系列疾病，例如動脈硬化、心血管疾病、癌癥、機體老化等[9]。因此，評價梔子油是否具有強的抗氧化活性是研究的必然趨勢。目前，還未見對梔子油抗氧化性的研究報道。本實驗對梔子油清除自由基能力進行研究，為梔子油的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

梔子油(以干燥水梔子全果為初始原料，由超臨界C O2萃取得到)；氯仿、正庚烷、正己烷、三氟化硼乙醚溶液、氫氧化鉀、過硫酸鉀(均為分析純) 北京化學試劑有限公司；DPPH、ABTS、水溶性VE、α-生育酚 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

華黎超臨界流體萃取裝置 杭州華黎泵業(yè)有限公司；AR114分析天平 上海奧豪斯國際貿(mào)易有限公司；電熱恒溫水浴鍋 北京長風儀器儀表有限公司；6890N氣相色譜儀 美國安捷倫科技有限公司；UV-1800型紫外-可見分光光度計 日本島津公司；漩渦混合器 北京金北德工貿(mào)有限公司；SENCO R系列旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海申生科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 超臨界CO2萃取

通過預試驗確定二級分離條件為：分離Ⅰ溫度40℃，壓力6.5MPa；分離Ⅱ溫度為室溫(30～35℃)，壓力5.8MPa。對可能影響萃取效果的因素——萃取壓力、萃取溫度和CO2流速進行單因素試驗，探討其對梔子油脂肪酸組成和抗氧化性的影響。單因素條件為萃取壓力15、22.5、30、37.5、45MPa，萃取溫度35、45、55、65、75℃，CO2流速5、10、15、20kg/h。

1.3.2 脂肪酸組成及含量分析

1.3.2.1 脂肪酸甲酯化

采用GB/T 17376—1998《動植物油脂：脂肪酸甲酯制備》方法[10]，取梔子油樣品約0.1g置于50mL磨口三角瓶中，加入6mL 0.5mol/L氫氧化鉀-甲醇溶液，搖勻后接入冷凝管，在80℃水浴中加熱并使溶液沸騰1h，再從直型冷凝管上口向瓶中加入7mL 15% BF3-甲醇溶液，反應2min后，再加入6mL正庚烷，繼續(xù)反應1min后，取出三角瓶，冷卻后立即加入飽和氯化鈉溶液至正庚烷液面接近三角瓶口，最后吸取上清液經(jīng)微孔濾膜(0.45μm)過濾，按預實驗確定的條件進行氣相色譜分析，取3次測定平均值。

1.3.2.2 氣相色譜分析條件

色譜柱：HP-Innowax(30m×0.32mm，0.25mm)；載氣：N2，1mL/min恒流；進樣口溫度250℃，分流比：1:20；進樣量：1μL；FID檢測器溫度：250℃；尾吹氣：N2，40mL/min；空氣流速：450mL/min；氫氣流速：45mL/min。程序升溫：初始170℃，保持14min，以10℃/min速度升溫至230℃，保持10min。

1.3.3 抗氧化活性分析

1.3.3.1 清除DPPH自由基能力的測定

在Shyu等[11]方法的基礎上加以改進，用氯仿配制0.1mmol/L D PPH溶液，向一系列的試管中加入3mL DPPH溶液，分別加入不同濃度的α-生育酚溶液或者0.04g/mL油樣品溶液1mL，空白組加入同體積的氯仿，振蕩20s后室溫避光隔氧放置30min，在517nm處測定吸光度，并計算自由基清除率。

式中：A0為DPPH空白對照的吸光度；A為30min后樣品與DPPH反應后的吸光度；B為樣品空白的吸光度。梔子油樣品的DPPH自由基清除能力與α-生育酚清除DPPH自由基能力相對比，確定其相對抗氧化性，以α-生育酚抗氧化當量表示，即每100g待測梔子油的自由基清除能力相當于α-生育酚對自由基清除的毫克數(shù)。

1.3.3.2 清除ABTS自由基能力的測定

采用Roberta等[12]的方法進行改良，稱取17mg過硫酸鉀加26mL水得過硫酸鉀溶液，取上述過硫酸鉀溶液2.6mL，加入10mg ABTS，配制成ABTS母液，暗處放置12～16h后，取上述母液0.8mL，用甲醇定容至50mL，制得ABTS溶液備用。向一系列試管中加3mL ABTS溶液，分別加入不同濃度的水溶性VE溶液或者用甲苯-甲醇(1:1)定容制得的0.01g/mL油樣品溶液1mL，空白組加入同體積的甲苯-甲醇(1:1)溶液，振蕩20s后室溫避光隔氧放置40min，在734nm處測定吸光度，計算ABTS自由基清除率。

式中：A0為ABTS空白對照的吸光度；A為40min后樣品與ABTS反應后的吸光度，梔子油樣品的ABTS自由基清除能力與水溶性VE清除ABTS自由基能力相對比，確定其相對抗氧化性，以水溶性VE抗氧化當量表示，即每100g待測梔子油的自由基清除能力相當于水溶性VE對自由基清除的微摩爾數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同萃取工藝條件對梔子油脂肪酸組成的影響

2.1.1 梔子油脂肪酸組成分析

本實驗采用氣相色譜(GC)對甲酯化的梔子油脂肪酸成分進行定性分析，梔子油的氣相色譜圖見圖1。通過與標準品的比對，并采用峰面積歸一化法，確定各脂肪酸組分在總脂肪酸中的百分含量，標準品的脂肪酸氣相色譜圖如圖2所示。由圖1經(jīng)分析可得，梔子油含有的脂肪酸種類相對較少，主要為亞油酸(C18:2)、油酸(C18:1)、棕櫚酸(C16:0)、硬脂酸(C18:0)和亞麻酸(C18:3n3)5種。在萃取壓力30MPa、溫度55℃、CO2流速15kg/h條件分別占44.38%、24.96%、24.83%、2.55%、1.31%(平均值)。經(jīng)GC分析得，梔子油中還含有花生酸、順-11-二十碳烯酸、順-11,14-二十碳二烯酸、順-11,14,17-二十碳三烯酸和順-8,11,14-二十碳三烯酸，但含量都十分稀少，均少于1%。

圖1 梔子油脂肪酸氣相色譜圖Fig.1 Gas chromatogram of fatty acids in gardenia oil

圖2 標準品脂肪酸氣相色譜圖Fig.2 Gas chromatogram of fatty acid standards

2.1.2 萃取壓力、溫度和CO2流速對梔子油脂肪酸組成的影響

圖3 萃取壓力對梔子油脂肪酸組成的影響Fig.3 Effect of extraction pressure on the fatty acid composition of gardenia oil

圖3～5分別是在55℃、CO2流速15kg/h條件下不同壓力和30MPa、CO2流速為15kg/h條件下不同溫度以及55℃、30MPa條件下不同CO2流速均經(jīng)過120min萃取后得到的梔子油的脂肪酸組成。

由圖3可知，不同萃取壓力對梔子油中各種脂肪酸含量的影響較小，其中含量最多的亞油酸僅在42.5%～44.4%之間做微小的波動，而其他脂肪酸的波動范圍則更小，差異不顯著(P＞0.05)。但值得注意的是，如表1所示，相比于其他壓力條件，30MPa壓力條件下萃取所得的梔子油中不飽和脂肪酸的總含量為最高。

表1 不同萃取壓力條件下梔子油中總不飽和脂肪酸含量Table1 Total unsaturated fatty acid contents in gardenia oils extracted under different extraction pressures

圖4 萃取溫度對梔子油脂肪酸組成的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on the fatty acid composition of gardenia oil

由圖4可知，不同萃取溫度對梔子油中各種脂肪酸含量的變化趨勢與萃取壓力對其的影響較為相似，差異亦不顯著，這與徐響在研究超臨界CO2萃取沙棘全果油時得出的結(jié)論相一致[13]。從圖4亦可明顯看出，油酸與棕櫚酸兩條曲線幾乎重合，且變化趨勢一致。硬脂酸及亞麻酸的含量更是幾乎無明顯變化。同樣地，由表2可知，相對其他溫度條件，55℃萃取所得的不飽和脂肪酸總含量最多。

表2 不同萃取溫度條件下梔子油中總不飽和脂肪酸含量Table2 Total unsaturated fatty acid contents in gardenia oils extracted under different extraction temperatures

由圖5可知，相對于萃取壓力和溫度，CO2流速對梔子油中脂肪酸組成的影響略為明顯。其中含量較高的亞油酸、油酸和棕櫚酸的波動趨勢均為先降低后升高再降低，且均在流速為5kg/h時已達到最大值，故流速的增加并不能提高此3種脂肪酸的萃取率。對于含量較低的亞麻酸，其整體波動較小，但變化趨勢則恰好相反，表現(xiàn)為先升高后降低再升高的趨勢，且在5kg/h時的含量最低，僅為最大值的58%。

圖5 CO2流速對梔子油脂肪酸組成的影響Fig.5 Effect of CO2flow rate on the fatty acid composition of gardenia oil

2.1.3 超臨界CO2與索氏萃取的梔子油脂肪酸含量的比較

選取條件為30MPa、55℃、15kg/h的超臨界CO2萃取與正己烷索氏提取的梔子油脂肪酸含量進行比較，見表3。由表可知，兩種萃取方法對梔子油脂肪酸含量的影響差異不顯著。梔子油主要含不飽和脂肪酸，其中多不飽和脂肪酸約45%，單不飽和脂肪酸約24%，飽和脂肪酸約27.5%。超臨界CO2萃取的梔子油不飽和脂肪酸含量較正己烷索氏提取的略高一些。這可能是因為超臨界CO2的萃取條件較溫和，對梔子油功效成分的保留效果較好。

2.2 不同萃取條件對梔子油清除自由基能力的影響

2.2.1 標準曲線的建立

將梔子油樣品的DPPH及ABTS自由基清除能力分別與α-生育酚和水溶性維生素E清除自由基能力相對比，本實驗采用α-生育酚和水溶性VE抗氧化當量表示梔子油抗氧化能力的大小，標準曲線見圖6、7。

圖6 α-生育酚-DPPH自由基清除率標準曲線Fig.6 Standard curve of scavenging effect ofα-tocopherol on DPPH radicals

圖7 水溶性VE-ABTS自由基清除率標準曲線Fig.7 Standard curve of scavenging effect of Trolox on ABTS+radicals

2.2.2 清除DPPH自由基的能力

圖8 萃取壓力、溫度、CO2流速對梔子油清除DPPH自由基能力的影響Fig.8 Effects of extraction pressure, temperature and CO2 flow rate on the DPPH scavenging capacity of gardenia oil

表3 超臨界CO2和索氏萃取的梔子油脂肪酸組成(n=3)Table3 Fatty acid composition of gardenia oils extracted supercritical CO2or n-hexane (n=3)%

2,2-二苯基-1-1苦肼基自由基(2,2-diphenyl-1-1picrylhydrazyl，DPPH)分析法是一種篩選自由基清除劑的簡便方法。DPPH自由基在有機溶劑中是一種穩(wěn)定的自由基，呈紫色，在517nm處有強吸收，當有自由基清除劑存在時，DPPH自由基具有的單電子被配對，使其顏色變淺，在最大吸收波長處的吸光值變小，且這種顏色的變淺程度與配對電子數(shù)成化學計量關(guān)系。因此，可通過分光光度法來評價自由基的清除情況。圖8顯示，梔子油對DPPH自由基具有一定的清除作用，其平均抗氧化能力相當于100g梔子油中含(95.74±0.82)mg α-生育酚。

從圖8(A)可以看出，15MPa萃取壓力下的梔子油清除DPPH自由基的α-生育酚抗氧化當量遠遠高于其他壓力條件；而其他四種壓力條件下的梔子油清除DPPH自由基的α-生育酚抗氧化當量相近，30MPa略低于其他3種壓力條件。這可能與不同萃取壓力下梔子油中生育酚的含量有關(guān)，劉光敏在研究超臨界CO2不同條件下石榴籽油的DPPH自由基清除能力時，也得出相同的規(guī)律，并已證明了不同萃取壓力下石榴籽油的DPPH自由基清除能力與其相應壓力下生育酚的含量變化規(guī)律基本一致[14]，這為梔子油的進一步研究提供了有力的參考。

從圖8(B)可以看出，萃取溫度對梔子油清除DPPH自由基的能力影響不大，其α-生育酚抗氧化當量始終在90mg/100g油附近波動。

從圖8(C)可以看出，CO2流速對梔子油清除DPPH自由基的α-生育酚抗氧化當量具有一定的影響，但無明顯規(guī)律性。

2.2.3 清除ABTS自由基的能力

ABTS法最先由Miller等[15]開創(chuàng)，用于測定生物樣品的抗氧化能力。ABTS這種水溶性的自由基引發(fā)劑為顯色劑，其被活性氧氧化后生成穩(wěn)定的藍綠色陽離子自由基ABTS＋·，向其中加入被測物質(zhì)，如果該物質(zhì)中存在抗氧化成分，則該物質(zhì)會與ABTS＋·發(fā)生反應而使反應體系褪色，然后在ABTS自由基的最大吸光波長(734nm)檢測吸光度的變化，即可判斷該物質(zhì)的清除能力。由圖9可知，梔子油對ABTS自由基也具有一定的清除作用，其平均抗氧化能力相當于100g梔子油中含(501.69±10.51)μmol水溶性VE。

從圖9(A)可以看出，萃取壓力對梔子油清除ABTS自由基能力的影響表現(xiàn)為先上升后下降的規(guī)律。當壓力為22.5MPa時，其水溶性VE抗氧化當量達到最大值，即536.01μmol/100g。當繼續(xù)升高壓力，其清除ABTS自由基的能力下降。原因可能是隨著壓力的升高，超臨界CO2流體的密度增大，對梔子油的溶解度增加，進而萃取得到的功效成分增多。但是壓力進一步增大時，可能使部分功效成分的結(jié)構(gòu)遭到破壞，從而使其對ABTS自由基的清除能力下降。

從圖9(B)可以看出，隨著萃取溫度的升高，梔子油清除ABTS自由基的水溶性VE抗氧化當量呈整體上升的趨勢，僅在45℃時略有下降，而后逐漸上升。

從圖9(C)可以看出，不同CO2流速條件下的梔子油清除ABTS自由基的水溶性VE抗氧化當量的變化趨勢同萃取壓力對其的影響，也呈現(xiàn)出先升后降的趨勢。原因可能是隨著流量的增大，濃度差也將增大，濃度差越大越利于提取，但是CO2流速加快，CO2停留時間將會變短，與萃取物的接觸時間會變少，所以當流速超過10kg/h時，CO2中溶解的功效成分反而下降。

圖9 萃取壓力、溫度、CO2流速對梔子油清除ABTS自由基能力的影響Fig.9 Effects of extraction pressure, temperature and CO2flow rate on the ABTS+scavenging capacity of gardenia oil

3 結(jié) 論

3.1 通過GC對不同萃取條件下梔子全果油中主要脂肪酸組成進行了定性與定量的研究，得出CO2流速對梔子油脂肪酸組成的影響相對略為明顯。萃取壓力、溫度對其影響不顯著，但是，在壓力和溫度分別為30MPa和55℃條件時，萃取所得的不飽和脂肪酸的總含量為最高。

3.2 梔子油對DPPH及ABTS自由基有一定的清除能力，說明梔子油中含有天然的自由基清除劑。通過單因素試驗，得出萃取壓力為15MPa時梔子油清除DPPH自由基的能力最大，其余壓力條件下清除能力較為相近。CO2流速對梔子油清除DPPH自由基能力的影響無明顯規(guī)律性；萃取壓力和CO2流速對清除ABTS自由基的影響均呈現(xiàn)出先升后降的趨勢。在30MPa、15kg/h條件下，隨著溫度的升高，梔子油清除ABTS自由基的能力整體呈上升趨勢，而溫度對清除DPPH自由基的能力則無明顯影響。

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Effect of Supercritical Carbon Dioxide Extraction Conditions on Fatty Acid Composition and Antioxidant Activity of Gardenia Fruit Oil

BAO Ya-ni，DONG Jian-qing，YUAN Fang*
(College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China)

The fatty acid composition of gardenia fruit oils extracted with supercritical CO2under varying conditions of pressure, temperature and CO2flow rate was determined by gas chromatography. The results showed that there were mainly 5 fatty acids in gardenia fruit oil, namely linoleic acid, oleic acid, palmitic acid, stearic acid and linolenic acid, of which the contents were respectively 44.38%, 24.96%, 24.83%, 2.55% and 1.31% in the oil extracted under 30 MPa, 55 ℃ and CO2 flow rate of 15 kg/h. Each of the three extraction conditions had some effect on the composition of fatty acids in gardenia fruit oil, which showed no statistical significance. It was found that gardenia fruit oil had the ability to scavenge DPPH and ABTS+free radicals, indicating its antioxidant activity. Moreover, extraction pressure, temperature and CO2 flow rate could affect the DPPH and ABTS+free radical scavenging activities of gardenia fruit oil to different extents.

gardenia oil；supercritical CO2；fatty acid composition；antioxidant activity

TS201.1

A

1002-6630(2011)10-0012-06

2010-08-05

教育部高校特色專業(yè)建設項目(TS10618)；北京市高校特色專業(yè)建設項目；中國農(nóng)業(yè)大學本科生科研訓練計劃“URP”項目

包亞妮(1989—)，女，本科生，研究方向為食品科學與工程。E-mail：bonie2009@yahoo.cn

*通信作者：袁芳(1967—)，女，副教授，碩士，研究方向為農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏。E-mail：yuanfang0220@163.com