韓慧霞綜述,陸洪光,王 魯審校

(1.貴陽醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院皮膚科,貴州貴陽550004;2重慶市第一人民醫(yī)院皮膚科 400011)

全長cDNA文庫及構(gòu)建方法與應(yīng)用進(jìn)展

韓慧霞1綜述,陸洪光1,王 魯2審校

(1.貴陽醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院皮膚科,貴州貴陽550004;2重慶市第一人民醫(yī)院皮膚科 400011)

DNA,互補(bǔ);基因組文庫;實(shí)驗(yàn)室技術(shù)和方法

互補(bǔ)DNA(complementary DNA,cDNA)文庫是指生物不同生長發(fā)育時(shí)期,特定組織或器官所轉(zhuǎn)錄的全部mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄形成的cDNA與載體連接后形成的克隆的集合,cDNA文庫是在基因組水平上研究某一生物特定器官、組織和發(fā)育時(shí)期基因表達(dá)的前提和基礎(chǔ)[1]。全長cDNA文庫是生物體內(nèi)完整的mRNA分子反轉(zhuǎn)錄而獲得的DNA分子群集,是mRNA分子群的一個(gè)完整的拷貝。全長cDNA文庫不僅提供完整的mRNA信息,而且可以通過基因序列比對(duì)得到mRNA剪接信息,此外,還可以對(duì)蛋白質(zhì)序列進(jìn)行預(yù)測及進(jìn)行體外表達(dá)和通過反向遺傳學(xué)研究基因的功能等[2]。全長cDNA文庫的優(yōu)點(diǎn)明顯,克隆大部分是全長的,有效提高了基因測序和生物信息學(xué)分析的進(jìn)程,利于后期蛋白質(zhì)表達(dá)及功能分析。目前幾乎所有構(gòu)建全長cDNA文庫的方法都是基于真核生物完整mRNA的一個(gè)共同特征——“帽子”結(jié)構(gòu),即 mRNA的 5′端存在的m7GpppNp-結(jié)構(gòu)。多數(shù)cDNA文庫構(gòu)建過程大致為分離總RNA,純化mRNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA,然后與兩端帶有限制性酶切位點(diǎn)的人工接頭相連接,并將其插入到載體中,轉(zhuǎn)染大腸桿菌,得到cDNA文庫。近年來全球眾多學(xué)者一直在有計(jì)劃、大規(guī)模地進(jìn)行一些重要模式生物的全長cDNA文庫的構(gòu)建及研究,如擬南芥、水稻、果蠅、小鼠及豬等[3],這些生物全長cDNA文庫已構(gòu)建完成,得到大量有重要價(jià)值的數(shù)據(jù)。本文主要介紹幾種比較常用的全長cDNA文庫的構(gòu)建方法及其應(yīng)用進(jìn)展。

1 Oligo-capping法

該法最早由Maruyama和Sugano[4]于1994年建立。它利用完整的mRNA分子具有5′端帽子結(jié)構(gòu),而部分降解的mRNA分子沒有此結(jié)構(gòu)的特點(diǎn),采用寡核苷酸(oligonucleotide)替換mRNA的帽子結(jié)構(gòu),并標(biāo)記mRNA的5′端。

首先利用細(xì)菌堿性磷酸酶(bacterial alkaline phosphatase,BAP)水解5′端無m7GpppNp-保護(hù)的部分,降解 5′磷酸基團(tuán),并防止截短的mRNA在后續(xù)反應(yīng)中與寡核苷酸連接;然后用煙草酸焦磷酸酶(tobacco acid pyrophosphatase,TAP)除去mRNA 5′端的帽子結(jié)構(gòu),暴露磷酸基團(tuán);再用 T4RNA連接酶在mRNA的5′端連上一個(gè)寡核苷酸,作為引發(fā)第二鏈合成的引物結(jié)合位點(diǎn);最后,經(jīng) RT-PCR擴(kuò)增、酶切、連接,只有完整的mRNA才能合成cDNA,建成目的全長cDNA文庫。不足之處在于其涉及多種酶促反應(yīng),各種酶的效率直接影響文庫的最終質(zhì)量,尤其是 T4RNA連接酶;mRNA經(jīng)過多步酶促反應(yīng)后,易發(fā)生降解,故RNA需要量大;PCR反應(yīng)對(duì)模板量及長度有一定選擇性,易影響難擴(kuò)增基因的克隆,導(dǎo)致文庫中克隆的代表性不強(qiáng);反應(yīng)所用的 TAP價(jià)格較貴,此法成本較高。有人對(duì)Oligo-capping法進(jìn)行改進(jìn),以少量總 RNA(約100μg)替代mRNA作起始材料,寡核苷酸替換帽子結(jié)構(gòu)后再分離mRNA進(jìn)行cDNA合成,可避免mRNA在酶處理過程中被降解,構(gòu)建的文庫在建庫效率、全長比例和代表性等方面都有所提高[5]。2004年Clepet等[6]用 T4DNA連接酶替代 T4RNA連接酶,在一定程度上提高了寡核苷酸mRNA的連接效率,提高了文庫全長比例。同年Ota等[7]用此法完成了21 243條日本人cDNA文庫的構(gòu)建和測序,所構(gòu)建文庫中大約有85%的克隆為全長。Kim等[8]改良此法,提出RNA連接酶介導(dǎo)的cDNA末端快速擴(kuò)增(RNA ligase-mediated rapid amplification of cDNA ends,RLM-RACE)。2006年 Sunderland等[9]用 RLMRACE確定擬南芥LIG1基因所有可能的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。2009年 Tsuchihara等[10]將Oligo-capping法與大規(guī)模平行測序技術(shù)結(jié)合,提出以高通量方式收集轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(transcription start sites,TSS)信息和定量分析轉(zhuǎn)錄物表達(dá)水平的方法。改良后的Oligo-capping法被廣泛用于實(shí)驗(yàn)研究。Sumio Sugano實(shí)驗(yàn)室利用此法不斷完善人類基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)數(shù)據(jù)庫和全長cDNA文庫,通過對(duì)選定人類和小鼠cDNA5′端的測序,獲得3.3億新標(biāo)簽[11-13]。

2 SMART法

RNA反轉(zhuǎn)錄5′末端交換機(jī)制(switching mechanism at 5′end of RNA transcript,SMART)是在第一鏈合成時(shí)使用專利SMART IVTM寡核苷酸產(chǎn)生大量全長雙鏈cDNA。此法是在PCR基礎(chǔ)上利用SMARTScribeTMMMLV反轉(zhuǎn)錄酶的末端轉(zhuǎn)移酶活性及限制性內(nèi)切酶SfiⅠ的特性,快速構(gòu)建全長cDNA文庫。SMARTScribeTMMMLV RT是由小鼠白血病病毒(moloney murine leukemia virus,MMLV)反轉(zhuǎn)錄酶點(diǎn)突變而獲得,無RNase H活性。當(dāng)反轉(zhuǎn)錄到達(dá)mRNA的5′端時(shí),RT能在相應(yīng)的核酸3′端添加一段oligo(dC),對(duì)于非全長cDNA,由于反轉(zhuǎn)錄沒有延伸到mRNA的5′端,RT不能在其不完整的3′端加上oligo(dC)。合成cDNA第二鏈時(shí),對(duì)于截短的第一鏈cDNA,反轉(zhuǎn)錄酶沒有識(shí)別到mRNA的5′端帽子結(jié)構(gòu),3′端攜帶的oligo(dG)第二鏈引物就不能與截短的第一鏈cDNA片段結(jié)合,最終得到的是全長雙鏈cDNA。在實(shí)驗(yàn)流程中,cDNA引物的5′端引入了 SfiⅠA和 SfiⅠB識(shí)別位點(diǎn),只需對(duì)目的cDNA進(jìn)行SfiⅠ單酶切,就可實(shí)現(xiàn)目的基因的定向克隆。此方法只需用少量起始材料(最低0.025μg的poly A+RNA或0.05μg的總 RNA)經(jīng)18～26次長距離DNA擴(kuò)增(long distance PCR,LD-PCR)或0.5～2.0μg的poly A+RNA通過引物延伸法合成雙鏈cDNA,對(duì)擴(kuò)增后的雙鏈cDNA進(jìn)行分級(jí)分離,然后進(jìn)行載體連接,轉(zhuǎn)化構(gòu)建全長文庫。mRNA在合成cDNA前無酶促反應(yīng)及化學(xué)處理,不會(huì)在處理過程中出現(xiàn)mRNA的降解和浪費(fèi)。產(chǎn)生的單鏈cDNA富含mRNA完整的5′非翻譯區(qū)(untranslated region,UTR),省去合成接頭的連接、甲基化等步驟,更易獲得全長克隆。

作為基于PCR的基因擴(kuò)增技術(shù),Wang等[14]將其用于擴(kuò)增侵襲性腫瘤細(xì)胞的cDNA,并鑒定和檢測基因表達(dá)特征;用此法構(gòu)建的還有腐霉、小麥條銹病菌等真菌的全長cDNA文庫[15-16];2006年Cheung等[17]構(gòu)建了蒺藜苜蓿的標(biāo)準(zhǔn)化cDNA文庫及cDNA質(zhì)粒文庫;2007年Du等[18]構(gòu)建了發(fā)情前小尾寒羊卵巢的全長cDNA文庫;2008年Vera等[19]用此法分別合成了格蘭維爾貝母蝴蝶幼蟲、蛹及成蟲的cDNA;2009年Fedorov等[20]構(gòu)建了冬眠的美洲黑熊的腦、肝、睪丸及骨骼肌的全長cDNA文庫。將SMART和雙鏈特異性核酸酶(duplex-specific nuclease,DSN)均一化技術(shù)結(jié)合是目前構(gòu)建全長均一化cDNA文庫的首選方法[21]。

3 CAP-trapper法

該法于1996年由Carninci等[22]建立,并用此法構(gòu)建了小鼠腦細(xì)胞全長cDNA文庫,全長比例超過95%,且僅需10μg起始mRNA。此法建庫原理是依據(jù)真核細(xì)胞mRNA的帽子結(jié)構(gòu)上存在一個(gè)相同的二醇?xì)埢?此二醇結(jié)構(gòu)經(jīng)氧化后與生物素結(jié)合而被標(biāo)記。生物素化的mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶催化,進(jìn)行第一鏈cDNA合成,接著經(jīng) RnaseⅠ酶切,去除所有非全長cDNA5′端及所有未被cDNA保護(hù)的mRNA的生物素標(biāo)簽,經(jīng)鏈霉親和素磁珠(免疫磁珠)吸附,弱堿降解,獲得的單鏈全長cDNA在末端轉(zhuǎn)移酶的催化下,5′端oligo(G)加尾,開始合成第二鏈,定向克隆獲得全長cDNA文庫。Carninci等[22]所在實(shí)驗(yàn)室不斷對(duì)此法進(jìn)行改進(jìn):(1)在全長cDNA合成時(shí),用海藻糖和山梨糖醇熱啟動(dòng)反轉(zhuǎn)錄,提高反轉(zhuǎn)錄酶熱穩(wěn)定性,減少反轉(zhuǎn)錄過程中的二級(jí)結(jié)構(gòu),提高全長cDNA的合成比例;(2)采用對(duì)甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶Ssth、BsaⅠ或BamHⅠ/Xhol替代 EcolⅠ/Xhol雙酶切,提高文庫的全長比例;(3)用核糖核酸單鏈連接法(single-strand linker ligation method,SSLLM)加尾,減少oligo(G)加尾對(duì)測序和蛋白質(zhì)翻譯的干擾,利于全長cDNA的有效轉(zhuǎn)錄和表達(dá)克隆。

2005年在Ng等[23]的研究中,采用此法獲得 E14小鼠胚胎干細(xì)胞的全長cDNA。2006年Carninci等[24]將此法用于哺乳動(dòng)物基因啟動(dòng)子的研究。2008年 Taji等[25]采用改良后的CAP-trapper法,用海藻糖熱啟動(dòng)反轉(zhuǎn)錄,構(gòu)建了鹽芥在高鹽度、嚴(yán)寒及酸性環(huán)境下的全長cDNA文庫。2009年Sato等[26]采用此法構(gòu)建全長cDNA文庫,對(duì)水稻和擬南芥的基因同源性進(jìn)行了比較分析。此外,用此法構(gòu)建的還有毛果楊樹[27]、大豆[28]和豌豆蚜蟲[29]等的全長cDNA文庫。

此法具有建庫效率高、全長比例高的優(yōu)點(diǎn),但酶促反應(yīng)多,mRNA暴露時(shí)間長,增加了mRNA降解的危險(xiǎn)性,部分降解的5′端也會(huì)被生物素標(biāo)記,尤其是技術(shù)要求高,流程長,需做同位素平行實(shí)驗(yàn),操作復(fù)雜。

4 Vector-Capping法

這是一種構(gòu)建高質(zhì)量cDNA文庫簡單而有效的方法。它利用T4 RNA連接酶將mRNA/cDNA雙鏈復(fù)合體中第一鏈cDNA的3′端連接到載體DNA的平端,這樣,全長cDNA就能以與錨定連接相同的方式在 5′端加上 G。Kato等[30]因cDNA在連接過程中加上載體作為“帽子”,故將這種方法命名為“Vector-capping”。根據(jù) Ohtake等[31]的研究,當(dāng)具有帽子結(jié)構(gòu)的mRNA作為模板時(shí),錨定連接產(chǎn)生的cDNA在5′端加上了dGMP,并且加上的核苷酸的堿基與帽子結(jié)構(gòu)的堿基互補(bǔ),這就意味著5′端出現(xiàn)的 G能保證cDNA的完整性。該法僅由3步組成:(1)利用反轉(zhuǎn)錄酶和載體引物合成第一鏈cDNA,所用載體是一端具有dT尾巴的線性載體;(2)用 T4RNA連接酶將第一鏈cDNA連接到載體引物的另一端;(3)利用Rnase H、E.coli DNA聚合酶Ⅰ及 E.coli DNA連接酶的活性,用cDNA替換mRNA。使用載體引物能達(dá)到定向插入的目的,有利于cDNA的測序及表達(dá),這種載體引物能由具有dT加尾的3′端突出位點(diǎn)和移除一端dT尾巴的鄰近位點(diǎn)的限制性酶切位點(diǎn)的質(zhì)粒載體制備而來。

用該法構(gòu)建高質(zhì)量cDNA文庫的關(guān)鍵因素是dT尾巴的長度和載體引物的純度。未剪切及未加尾的載體會(huì)增加文庫的背景干擾,必須盡可能除去。建庫的關(guān)鍵步驟是第二步,利用T4RNA連接酶的活性環(huán)化cDNA-載體引物雙鏈,雖然連接效率很低,但得到轉(zhuǎn)化子的數(shù)量已能滿足建庫需要。該法在簡易性、有效性、全長比例和cDNA質(zhì)量等方面較傳統(tǒng)方法有顯著優(yōu)勢(shì)。

目前,許多實(shí)驗(yàn)室已采用此法構(gòu)建多種生物組織的cDNA文庫。Osada等[32]比較Vector-capping法和Oligo-capping法所建文庫的冗余性發(fā)現(xiàn):用Vector-capping法構(gòu)建食蟹及彌猴肝細(xì)胞文庫的冗余性為3.21,用Oligo-capping法構(gòu)建食蟹及獼猴肝細(xì)胞文庫的冗余性為5.19,明顯高于Vactor-capping法(P<0.001)。Watanabe等[33]構(gòu)建了多種頂復(fù)門原蟲,如4種致病性瘧原蟲、剛第弓形蟲、多房棘球絳蟲及小隱孢子蟲的全長cDNA文庫。2008年Oshikawa等[34]構(gòu)建了人類視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞ARPE-19的全長cDNA文庫,所建文庫全長比例超過95%,大片段克隆長達(dá)11 199 bp。Aboge等[35]構(gòu)建了野生型gibson巴貝蟲的全長cDNA文庫,篩選出gibson巴貝蟲的二氫葉酸還原酶-胸苷酸合成酶(dihydrofolate reductasethymidylate synthase,DHFR-TS)的基因,證明DHFR-TS是治療gibson巴貝蟲病的抗葉酸類藥物的作用靶位。此外,用此法構(gòu)建的還有蕪菁[36]和煙草BY-2對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞[37]的全長cDNA文庫。

5 小 結(jié)

全長cDNA文庫較傳統(tǒng)cDNA文庫更有優(yōu)勢(shì),其重要性決定了它是目前全長新基因克隆、基因鑒定和基因組功能研究的必要工具,是現(xiàn)代生物學(xué)研究不可或缺的重要手段。研究者可通過構(gòu)建生物全長cDNA文庫,獲得完整的基因全序列信息,從中尋找特異性基因片段,利用核酸、抗體探針篩選文庫,從而獲得目的基因片段數(shù)據(jù)。隨著分子生物學(xué)理論和技術(shù)的發(fā)展,全長cDNA文庫的構(gòu)建方法日臻完善。以上所介紹的4種方法目前應(yīng)用已較為成熟,其中SMARTTM試劑盒作為產(chǎn)品推出,現(xiàn)已廣泛用于多種生物的全長cDNA文庫構(gòu)建和基因研究。Vector-capping法優(yōu)點(diǎn)明顯,所建文庫的全長比例是所有方法中最高的,克服了傳統(tǒng)方法的眾多局限和缺點(diǎn),有望被廣泛推廣應(yīng)用。研究者應(yīng)根據(jù)所研究生物的生理、病理因素,基因研究目的及研究者所在實(shí)驗(yàn)室條件,選擇適合的全長cDNA文庫的構(gòu)建方法,使各種建庫方法在使用中能夠充分發(fā)揮各自優(yōu)點(diǎn)。

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