王艷君 楊謙

(福建師范大學(xué)福清分校，福清，350300)(哈爾濱工業(yè)大學(xué))

木聚糖是大量存在于植物體內(nèi)的植物纖維，在自然界的儲(chǔ)量?jī)H次于纖維素［1］。木聚糖酶(EC 3.2.1.8)是催化降解木聚糖的一類糖基水解酶，它可將由β－1，4－木糖苷鍵組成的木聚糖降解成低聚糖或木糖。木聚糖酶在飼料工業(yè)、功能性食品、紡織業(yè)、廢水處理、生物燃料、造紙等方面具有廣闊的應(yīng)用前景而備受關(guān)注。國(guó)內(nèi)外對(duì)木聚糖酶進(jìn)行了較多的研究，尤其是絲狀真菌可產(chǎn)生分泌到胞外的木聚糖酶，便于酶的分離純化，加之絲狀真菌的產(chǎn)酶水平高于細(xì)菌及酵母菌［2］，因此，對(duì)絲狀真菌尤其是木霉屬(Trichoderma)和曲霉屬(Aspergillus)的研究較多。角毛殼菌(Chaetomium cupreum)是一種重要的生物防治真菌，其生防作用除產(chǎn)生毒素及抗生素外，還可以產(chǎn)生大量的細(xì)胞壁降解酶，許多木聚糖酶已從微生物中克隆得到，但在角毛殼菌中尚未見報(bào)道。本研究從角毛殼菌中克隆得到木聚糖酶基因(xyn24)，為研究該菌的生防機(jī)制及其生防能力的改造奠定基礎(chǔ)。利用生物信息學(xué)手段進(jìn)行分析，為進(jìn)一步表達(dá)、純化及大量制備重組xyn24蛋白及相關(guān)功能研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

角毛殼菌菌株為哈爾濱工業(yè)大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室保存;Ex－Taq DNA聚合酶、T4連接酶、限制性內(nèi)切酶、IPTG等為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品;引物由上海英俊生物技術(shù)有限公司合成;膠回收試劑盒購(gòu)自上海華舜公司;其他生化試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 木聚糖酶xyn24基因全長(zhǎng)cDNA的獲得

角毛殼菌菌絲體培養(yǎng):角毛殼菌孢子接入PD液體培養(yǎng)基中，在27℃、220 r/min條件下培養(yǎng)48 h。4 000 r/min離心10 min收集菌絲，液氮速凍后于冰箱中－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

角毛殼菌木聚糖酶基因ESTs序列的獲得:哈爾濱工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與工程實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建了角毛殼菌菌絲體時(shí)期的cDNA文庫(kù)，利用BlastX軟件對(duì)角毛殼菌菌絲體的3 066條ESTs序列進(jìn)行相似性搜索［3］。從中獲得角毛殼菌木聚糖酶基因的EST序列，登錄號(hào)為DV547992。

1.2.2 木聚糖酶xyn24基因全長(zhǎng)DNA的獲得

角毛殼菌基因組的提取:采用改良的CTAB法［4］，取1.0 g的菌絲于液氮中研成粉末后，加600 μL預(yù)熱的2×CTAB使之充分混勻，65℃水浴10 min，不時(shí)混勻;10 000 r/min離心，棄去上清，加600 μL預(yù)熱的2×CTAB使之充分混勻，65℃水浴10 min，不時(shí)混勻;加等體積氯仿/異戊醇(V(氯仿)∶V(異戊醇)=24∶1)進(jìn)行抽提，緩慢顛倒混勻10 min，10 000 r/min下高速離心10 min，上清轉(zhuǎn)入新的離心管中，棄去沉淀(重復(fù)2～3次);上清液加入等體積的異丙醇，于室溫沉淀DNA 15 min，10 000 r/min離心10 min，棄去上清;75%乙醇洗滌沉淀2次;加入適量TE，65℃溶解10 min;純化后的角毛殼菌菌絲基因組DNA于－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

角毛殼菌木聚糖酶基因的擴(kuò)增:以角毛殼菌基因組為模板，PCR擴(kuò)增xyn24基因的DNA序列所使用的引物為:上游引物，5'－GACGATGGTCTCCTTCAAGGCTCT－3';下游引物，5'－CGGTTAGACAGTGATGCTGGAAGAAC－3'在上下游引物中分別引入EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)，(加框處為酶切位點(diǎn))。擴(kuò)增程序?yàn)?4℃、5 min;94℃、30 s，56℃、30 s，72℃、30 s，35個(gè)循環(huán);72℃、7 min。PCR產(chǎn)物回收純化，與pMD18－T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)，涂布在含有氨芐青霉素的LB平板上。用IPTG和X－gal進(jìn)行藍(lán)白斑選擇，從白色菌落(氨芐抗性轉(zhuǎn)化子)提取質(zhì)粒并酶切鑒定，將陽(yáng)性克隆命名為pMD－T/Xyn，送上海博亞公司測(cè)序。

1.2.3 序列分析

用ORF軟件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)尋找開放讀碼框;Pfam(http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/)進(jìn)行蛋白家族預(yù)測(cè)以及用ProtParam軟件(http://au.expasy.org/tools/protparam.html)計(jì)算蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量及等電點(diǎn)。

用BlastP進(jìn)行相似性搜索，選擇了11條與角毛殼菌xyn24基因氨基酸序列相似性高的真菌木聚糖酶氨基酸序列;用MEGA4.0軟件對(duì)上述12種真菌的木聚糖酶基因的氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)，構(gòu)建進(jìn)化樹;BlastX(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)進(jìn)行序列同源性搜索;BlastP(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)進(jìn)行保守區(qū)預(yù)測(cè);Prosite(http://www.expasy.org/cgi－bin/prosite)分析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域。SignalP 3.0 Server(ExPASy Proteomics tools)進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 角毛殼菌xyn24基因全長(zhǎng)DNA及cDNA序列的獲得

提取角毛殼菌基因組作為模板，PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物片段如圖1所示，瓊脂糖凝膠電泳純化回收后，送交上海博亞公司測(cè)序。獲得全長(zhǎng)DNA序列，并提交GenBank注冊(cè)，登錄號(hào)為EF026977。

圖1 xyn24基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2 角毛殼菌xyn24基因核苷酸序列分析

開放讀碼框由起始密碼子ATG至終止密碼子TAA(圖2)，共有690個(gè)堿基組成，編碼229個(gè)氨基酸，由1個(gè)內(nèi)含子和2個(gè)外顯子組成，cDNA登錄號(hào)為DQ886937，DNA登錄號(hào)為EF026978。ProtParam分析表明該蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量為24700，理論等電點(diǎn)為7.83，分子式為C1105H1620N306O340S3，不穩(wěn)定系數(shù)為17.47，屬于穩(wěn)定的蛋白質(zhì)。

圖2 xyn24的ORF序列及推斷的氨基酸序列

2.3 角毛殼菌xyn24基因進(jìn)化樹結(jié)構(gòu)

xyn24基因推斷的蛋白質(zhì)序列與其相似性較高的11種真菌木聚糖酶蛋白質(zhì)序列進(jìn)行BlastP比對(duì)，結(jié)果表明，角毛殼菌xyn24基因推斷的氨基酸序列與嗜熱革節(jié)孢菌(Scytalidium thermophilum AB114442)、細(xì)麗毛殼菌(Chaetomium gracile D49850)、柰恩端梗霉(Acrophialophora nainiana DQ641721)、球毛殼菌(Chaetomium globosum XM001221294)、粗糙鏈孢霉(Neurospora crassa XM959052)、嗜熱毛殼菌(Chaetomium thermophilum AJ508932)、費(fèi)希爾曲霉(Neosartorya fischeri XM001258637)、構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans XM656125)、土曲霉(Aspergillus terreus XM001216082)、禾旋孢腔菌(Cochliobolus sativus AJ004802)、玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica AJ548879)木聚糖酶基因序列相似性分別為78%、75%、74%、72%、72%、66%、64%、64%、64%、63%、61%。采用鄰接法分析12種真菌的木聚糖酶蛋白的進(jìn)化順序，結(jié)果如圖3所示，xyn24蛋白與來源于嗜熱革節(jié)孢菌的的木聚糖酶處在同一組中，兩者的親緣關(guān)系最近，與球毛殼菌、嗜熱毛殼菌、細(xì)麗毛殼菌的親緣關(guān)系相對(duì)較近。

2.4 角毛殼菌xyn24蛋白結(jié)構(gòu)域及合成后的化學(xué)修飾位點(diǎn)預(yù)測(cè)

通過BlastP進(jìn)行保守區(qū)預(yù)測(cè)(圖4)，該木聚糖酶基因?qū)儆谔腔饷?1家族，具有糖基水解酶家族11的保守區(qū)結(jié)構(gòu)域，預(yù)測(cè)結(jié)果表明，糖基水解酶家族11結(jié)構(gòu)域上具有2個(gè)活性位點(diǎn)，分別在第123～133位及第214～225位的氨基酸位置上。分析表明，該木聚糖酶蛋白共有N－豆蔻酰化位點(diǎn)10個(gè);蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)4個(gè);N－糖基化位點(diǎn)2個(gè)。表1列出了各位點(diǎn)在229個(gè)氨基酸序列中的位置及氨基酸組成。

2.5 角毛殼菌xyn24蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)

木聚糖酶大多是胞外酶，都具有信號(hào)肽序列，經(jīng)SignalP 3.0－NN預(yù)測(cè)結(jié)果(圖5)表明，xyn24在16(A)～17(L)位為信號(hào)肽切割位點(diǎn)。比較其他11種不同來源的同源性較高的木聚糖酶蛋白的信號(hào)肽切割位點(diǎn)見表2所示，經(jīng)選擇12種不同真菌的木聚糖酶蛋白的信號(hào)肽切割位點(diǎn)符合下列通式:AX1A～X2P(其中X1為L(zhǎng)，A，F(xiàn);X2為L(zhǎng)，F(xiàn)，A，M，S，T出現(xiàn)的頻率較高)。

圖3 12種真菌木聚糖酶蛋白進(jìn)化樹

圖4 木聚糖酶xyn24保守區(qū)預(yù)測(cè)結(jié)果

圖5 角毛殼菌xyn24信號(hào)肽預(yù)測(cè)

表1 木聚糖酶xyn24合成后的化學(xué)修飾位點(diǎn)

表2 不同來源的真菌木聚糖酶基因的信號(hào)肽序列

2.6 角毛殼菌xyn24蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

通過SWISS－MODEL(http://swissmodel.expasy.org/repository/)對(duì)其三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果如圖6所示，xyn24含有一個(gè)α－螺旋并在外側(cè)，β折疊扭曲成一個(gè)空穴，可作為酶作用的活性位點(diǎn)。這種單一的β折疊結(jié)構(gòu)符合糖基水解酶家族11的結(jié)構(gòu)特征。

圖6 預(yù)測(cè)木聚糖酶xyn24三級(jí)結(jié)構(gòu)

3 結(jié)論與討論

角毛殼菌基因組的提取過程中，真菌細(xì)胞壁的破碎是不可忽視的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，本研究采用液氮研磨的方法，快速、低溫、研磨充分，高質(zhì)量的基因組模板提高了后續(xù)實(shí)驗(yàn)成功的可能性。

木聚糖酶根據(jù)其催化區(qū)氨基酸序列的組成不同，可分為糖基水解酶10和11家族［5］，此外還有一些木聚糖酶屬于第5、7、8、43糖基水解酶家族。糖基水解酶10家族的木聚糖酶的催化區(qū)是圓柱型(β/α)8結(jié)構(gòu)［6］，而糖基水解酶11家族的催化區(qū)結(jié)構(gòu)是2個(gè)反相平行的β片狀褶折和一個(gè)α螺旋組成，僅含有唯一的α－螺旋并在外側(cè)［7］，本研究克隆得到的xyn24具有糖基水解酶11家族催化區(qū)結(jié)構(gòu)域的明顯結(jié)構(gòu)特征。

xyn24基因具有一個(gè)很強(qiáng)的信號(hào)肽區(qū)，含有信號(hào)肽的蛋白質(zhì)一般能夠被分泌到細(xì)胞外，可能作為重要的細(xì)胞因子起作用，從而具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。從本研究克隆得到的木聚糖酶基因xyn24及其相似性比對(duì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其信號(hào)肽切割位點(diǎn)處的氨基酸A－A－P是進(jìn)行信號(hào)肽識(shí)別和切割的關(guān)鍵部位。

蛋白質(zhì)生物合成后活性調(diào)節(jié)的另外一種形式是化學(xué)修飾，包括蛋白質(zhì)的糖基化和磷酸化。木聚糖酶的重要翻譯后加工位點(diǎn)是N－位和O－位糖基化。木聚糖酶蛋白經(jīng)過糖基化修飾以后可以使整個(gè)酶蛋白在體內(nèi)避免蛋白水解酶的作用，保持其穩(wěn)定性，對(duì)于正常發(fā)揮木聚糖酶的功能具有重要作用。磷酸化是蛋白質(zhì)合成后廣泛存在的一種化學(xué)修飾，是控制酶活性的重要步驟。許多情況下，磷酸化的蛋白質(zhì)其酶活性大大提高;也有些情況下，磷酸化的蛋白質(zhì)其酶活性下降甚至消失，從而對(duì)蛋白質(zhì)的功能調(diào)節(jié)起重要作用。通過對(duì)xyn24蛋白的化學(xué)修飾位點(diǎn)的預(yù)測(cè)推斷，該蛋白的體外表達(dá)載體的選擇十分重要，如選擇比較優(yōu)秀的巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)，是木聚糖酶蛋白產(chǎn)物在體外具有酶活性的關(guān)鍵。因此，通過生物信息學(xué)的分析論證為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的成功奠定基礎(chǔ)。

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