韓麗華 張紹璐

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040)

如何運(yùn)用生物學(xué)的方法經(jīng)濟(jì)有效地去除水體中的氨氮是近年來廢水處理研究領(lǐng)域的一個(gè)熱點(diǎn)。傳統(tǒng)生物脫氮工藝將硝化和反硝化作為兩個(gè)相互獨(dú)立的階段，使二者在空間和時(shí)間上分開:硝化過程是由自養(yǎng)硝化細(xì)菌在好氧條件下將氨態(tài)氮通過亞硝酸鹽向硝酸鹽的轉(zhuǎn)換，反硝化過程是由異養(yǎng)的反硝化細(xì)菌在嚴(yán)格缺氧的條件下將硝態(tài)氮或亞硝態(tài)氮還原為氮?dú)饣騈2O［1］，這無疑增加了運(yùn)行成本和操作難度。如果能訓(xùn)育出在好氧條件下也能進(jìn)行反硝化的微生物，并與硝化細(xì)菌混合培養(yǎng)，則可以將硝化反硝化過程控制在一個(gè)反應(yīng)器中，并且硝化反應(yīng)的產(chǎn)物可以直接作為反硝化反應(yīng)的底物，避免對(duì)硝化反應(yīng)的抑制;同時(shí)，兩個(gè)反應(yīng)各自產(chǎn)生的酸堿可以互相中和，維持系統(tǒng)中pH值相對(duì)穩(wěn)定，從而實(shí)現(xiàn)同步硝化—反硝化過程(SND)［2］。

目前已知的好氧反硝化菌有Klebsiella pneumoniae［3］、Comamonas testosteroni［4］、Pseudomona sputida［5］等，研究還發(fā)現(xiàn)許多好氧反硝化菌(如Thiosphaera pantotropha，Pseudomonasspp.，Alcaligenesfaecalis等)同時(shí)也是異養(yǎng)硝化菌，能夠直接地把轉(zhuǎn)化為最終氣態(tài)產(chǎn)物而逸出［6］。由于好氧反硝化菌及好氧反硝化理論的形成，才使得真正意義上的SND得以實(shí)現(xiàn)。

有效生物群(Effective Micro－organisms，EM)始于20世紀(jì)80年代初，是由日本琉球大學(xué)比嘉照夫教授發(fā)明研制的一種新型復(fù)合微生物活菌制劑［7］。它采用獨(dú)特的發(fā)酵工藝，把好氧和厭氧微生物按一定的比例混合，培養(yǎng)出多種性的微生物群落，具有微生物菌群多、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、對(duì)污染物降解能力強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)。在微生物生態(tài)學(xué)中的分子生物學(xué)方法領(lǐng)域，1993年Muyzer等［8］最初將變性梯度凝膠電泳DGGE技術(shù)引入微生物生態(tài)研究。DGGE技術(shù)是多態(tài)性分析技術(shù)的一種，可依據(jù)雙鏈DNA片斷熔解行為的不同，用于分離PCR產(chǎn)物中長(zhǎng)度相同但序列不同的DNA標(biāo)記片斷。這種方法可以有效地避免在傳統(tǒng)富集、培養(yǎng)、分離研究過程中造成的微生物多樣性丟失、種群構(gòu)成發(fā)生變化等弊病，能夠更直接、可靠地反映出微生物的原始組成及演變情況。

本研究將PCR－DGGE技術(shù)運(yùn)用到了好氧反硝化細(xì)菌和硝化細(xì)菌的有效生物群聯(lián)合馴化培養(yǎng)當(dāng)中，使整個(gè)馴化過程更為直觀與可控，所獲得菌群的脫氮性能更加穩(wěn)定與高效，應(yīng)用價(jià)值更高，是對(duì)微生物馴化技術(shù)與SND生物脫氮技術(shù)的有力補(bǔ)充。

1 材料方法

1.1 培養(yǎng)基

初篩培養(yǎng)基(1 L):NaHCO38 g、CH3COONa 8 g、(NH4)SO41 g、NaNO20.1 g、NaCl 1 g、MgSO40.25 g、K2HPO41 g、微量元素溶液2 mL，pH=7～8。

復(fù)篩培養(yǎng)基(1 L):NaHCO34 g、CH3COONa 4 g、(NH4)SO41 g、NaCl 1 g、MgSO40.25 g、K2HPO41 g、微量元素溶液2 mL，pH=7～8。

微量元素溶液(1 L)［9］:EDTA 50.0 g、ZnSO42.2 g、CaCl25.5 g、MnCl2·4H2O 5.06 g、FeSO4·7H2O 5.0 g、(NH4)6Mo7O2·4H2O 1.1 g、CuSO4·5H2O 1.57 g、CoCl2·6H2O 1.61 g，pH=7.0。

1.2 培養(yǎng)方法

整個(gè)篩選馴化過程控制在好氧條件下，過程中定時(shí)檢測(cè)氨態(tài)氮(—N)、亞硝態(tài)氮—N)和硝態(tài)氮—N)的變化情況。整個(gè)過程分為:初篩、復(fù)篩及馴化。

1.2.1 初篩

初篩菌源分別取自哈爾濱文昌污水廠A/O池好氧段新鮮污泥、哈爾濱市馬家溝底污泥、廁所旁土壤及東北林業(yè)大學(xué)林場(chǎng)土壤。采用初篩脫氮培養(yǎng)基，按10%接種量將新鮮污泥(菌液)10 mL接種至裝有90 mL培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，θ=30℃，180 r·min－1振蕩培養(yǎng)，并在三角瓶中裝幾粒玻璃珠(盡量減小厭氧微環(huán)境對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響)。培養(yǎng)周期為4 d，共培養(yǎng)2個(gè)周期(下一馴化周期取上周期菌液作為菌源)，每周期結(jié)束檢測(cè)氨氮含量。

1.2.2 復(fù)篩及馴化

用初篩得到的篩選產(chǎn)物作為復(fù)篩的菌源，采用復(fù)篩培養(yǎng)基，按10%接種量將菌液10 mL接種至裝有90 mL培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，θ=30℃，180 r·min－1振蕩培養(yǎng)，并在三角瓶中裝幾粒玻璃珠(盡量減小厭氧微環(huán)境對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響)。培養(yǎng)周期為2 d，每4個(gè)周期為1個(gè)階段(每階段提取一次脫氮菌群總DNA樣品，保存)，每周期結(jié)束檢測(cè)氨氮、亞硝態(tài)氮、硝態(tài)氮含量。

1.3 分析方法

氨氮測(cè)定:納氏試劑分光光度法。亞硝酸鹽測(cè)定:N－(1－萘基)－乙二胺光度法。硝酸鹽測(cè)定:紫外分光光度法［10］。

1.4 菌群總DNA提取

基于SDS的裂解法［11］。

1.5 基因組總DNA16S rDNA V3區(qū)擴(kuò)增

16 S rRNA基因V3區(qū)的引物:將純化后的基因組的DNA作為聚合酶鏈接反應(yīng)(PCR)的模板，采用兩組對(duì)大多數(shù)細(xì)菌和古細(xì)菌的16S rRNA基因V3區(qū)具有特異性的引物對(duì)［12］，即組合1(F357GC和R518)和組合2(F357GC和R518)。F357，(5'－CC TAC GGG AGG CAG CAG－3')，R518，(5'－ATT ACC GCG GCT GCT GG－3')，GC發(fā)卡結(jié)構(gòu)，(5'－CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG G－3')。引物組合1擴(kuò)增產(chǎn)物片段長(zhǎng)度約為230 bp，而組合2約為190 bp。

PCR反應(yīng)條件:采用降落PCR策略，即預(yù)變性條件為94℃、3 min，前15個(gè)循環(huán)為94℃、1 min，60℃、1 min和72℃、1 min，后20個(gè)循環(huán)為94℃、1 min，50℃、1 min和72℃、1 min，最后在72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.6 變性梯度凝膠電泳(DGGE)分析

采用Bio－RAD公司DCodeTM的基因突變檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行分離。

變性梯度膠的制備:使用梯度混合裝置，制備8%的聚丙烯酰胺凝膠，變性質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%～70%(100%變性劑為7 mol·L－1尿素和40%去離子甲酰胺的混合物)，其中變性劑的質(zhì)量分?jǐn)?shù)從膠的上方向下一次遞增。

PCR樣品的加樣:待膠完全凝固后，將膠板放入裝有電泳緩沖液的裝置中，每個(gè)點(diǎn)樣孔加20 μL PCR樣品及10 μL的2倍濃度的loading Dye染料。

電泳及染色:在90～95 V電壓60℃電泳14 h電泳結(jié)束后，將凝膠進(jìn)行銀染。

DGGE指紋圖譜DNA條帶分析。應(yīng)用凝膠分析軟件Quantity One對(duì)掃描所得DGGE圖譜進(jìn)行條帶識(shí)別和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 好氧脫氮菌群的初篩結(jié)果

在長(zhǎng)期的生存進(jìn)化過程中，由于不同的生物菌群長(zhǎng)期處于不同的生態(tài)環(huán)境中，其生理和代謝功能也不一樣，致使不同生物菌群對(duì)氨氮去除能力不同。本研究初篩所得的污水廠A/O池好氧段新鮮污泥中生物菌群對(duì)氨氮去除率最高，達(dá)到76%，東北林業(yè)大學(xué)林場(chǎng)土壤中生物菌群對(duì)氨氮去除能力最低，僅為10%。

2.2 好氧脫氮菌群的復(fù)篩及馴化結(jié)果

所需目的菌群為脫氮菌群，只考查氨氮去除率不能符合脫氮功能的要求，故需對(duì)初篩得到的菌群復(fù)篩并加以馴化，以得到更穩(wěn)定高效的好氧脫氮菌群。復(fù)篩培養(yǎng)基中唯一的氮源為(NH4)SO4，但隨著硝化反應(yīng)的進(jìn)行，亞硝態(tài)氮和硝態(tài)氮應(yīng)該作為硝化反應(yīng)的產(chǎn)物出現(xiàn)，而事實(shí)上，反應(yīng)過程中氨氮的降解率達(dá)到90.1%，但是卻未檢測(cè)到亞硝態(tài)氮和硝態(tài)氮的產(chǎn)生。這表明系統(tǒng)內(nèi)也同時(shí)發(fā)生了反硝化反應(yīng)，即硝化與反硝化反應(yīng)同時(shí)在一個(gè)系統(tǒng)內(nèi)發(fā)生，硝化反應(yīng)的產(chǎn)物直接作為反硝化反應(yīng)的底物被利用。馴化過程氨氮去除率如表1所示。

表1 復(fù)篩階段氨氮去除率

2.3 脫氮過程中氨氮、亞硝態(tài)氮、硝態(tài)氮轉(zhuǎn)化過程

為了明確在該脫氮過程中亞硝態(tài)氮和硝態(tài)氮的降解過程，對(duì)該脫氮菌群分別添加一定量的亞硝態(tài)氮和硝態(tài)氮，從它們的變化過程及氮元素的平衡推測(cè)脫氮機(jī)理。在培養(yǎng)基中只添加亞硝酸鹽為氮源時(shí)，亞硝態(tài)氮能在短期內(nèi)被降解，24 h去除率達(dá)98.1%。當(dāng)在培養(yǎng)基中只添加硝酸鹽為氮源，硝態(tài)氮仍能在短期內(nèi)被降解，24 h去除率達(dá)95.2%，且亞硝態(tài)氮及硝態(tài)氮去除率曲線呈與細(xì)菌生長(zhǎng)曲線同趨勢(shì)，如表2所示。

表2 亞硝酸鹽及硝酸鹽去除率

整個(gè)過程中NH+4－N被降解而沒有NO－2－N和NO－3－N積累的現(xiàn)象，這說明該脫氮菌群中既含有能進(jìn)行亞硝酸鹽還原反應(yīng)的亞硝酸鹽還原菌，又具有能進(jìn)行硝酸鹽還原反應(yīng)的硝酸鹽還原菌。至于脫氮過程中該菌群是否發(fā)生短程同時(shí)硝化—反硝化還有待進(jìn)一步研究。

2.4 PCR－DGGE分析

當(dāng)該脫氮菌群脫氮速率達(dá)到相對(duì)穩(wěn)定值時(shí)，對(duì)每階段該脫氮菌群的種群變化進(jìn)行PCR－DGGE分析(圖1)。根據(jù)變性梯度凝膠電泳分離原理，PCR－DGGE帶譜中的每一條帶代表一個(gè)可能的細(xì)菌類群和可操作分類單位(OUT)，電泳條帶越多說明生物多樣性豐富;條帶信號(hào)越強(qiáng)，表示該種屬的數(shù)量越多，從而可以確定不同活性污泥中所含有的微生物的種類和數(shù)量關(guān)系，得出其中微生物多樣性的信息。通過該菌群各階段的條帶比較可以明顯發(fā)現(xiàn)菌群的演變過程，第3、4階段已無明顯變化，加之第3、4階段脫氮速率也達(dá)到相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)，說明生物群落的演變情況與氮素去除指標(biāo)的變化是相吻合的，目的脫氮菌群訓(xùn)育成功。

圖1 馴化期間各階段微生物群落DGGE分離圖譜1－4分別為馴化的第1、2、3、4階段。

3 討論

目前人們對(duì)于同步硝化反硝化的反應(yīng)機(jī)理仍存在不同的觀點(diǎn)。其中宏觀環(huán)境理論和物理學(xué)微環(huán)境理論都還是沒有擺脫傳統(tǒng)的好氧缺氧生物脫氮模式［13］。其所說的好氧反硝化，其實(shí)質(zhì)仍然是缺氧微環(huán)境下的反硝化，不能稱之為真正意義上的好氧反硝化［14］。生物學(xué)微生物理論認(rèn)為，SND正是在好氧反硝化菌、低DO下的硝化菌、異養(yǎng)硝化菌及自養(yǎng)反硝化菌作用的條件下才得以進(jìn)行［13］。Patureau等從升流式缺氧濾池中分離出了好氧反硝化菌SGLY2，而后在好氧條件下和硝化細(xì)菌混合培養(yǎng)，氨氮被自養(yǎng)硝化細(xì)菌氧化，同時(shí)伴隨硝酸鹽氮被異養(yǎng)好氧反硝化菌還原成分子氮，將硝化和反硝化控制在同一反應(yīng)器［15］。Robertson［16］等人證實(shí)了Pseudomonas Sp.，Alcaligenes faecalis，Thiosphaera Pantotropho等好氧反硝化菌也是異養(yǎng)硝化菌，可直接將氨轉(zhuǎn)化成最終氣態(tài)產(chǎn)物逸出，這樣就實(shí)現(xiàn)了同時(shí)硝化反硝化。耿金菊等對(duì)好氧脫氮微生物的混合培養(yǎng)脫氮過程進(jìn)行研究，驗(yàn)證可以在好氧條件下將氨氮最終轉(zhuǎn)化為氮?dú)馀欧牛?］。本研究從同步硝化反硝化的生物學(xué)微生物理論出發(fā)，通過初篩和復(fù)篩馴化最終獲得可在好氧條件下脫氮的有效微生物群。經(jīng)對(duì)氮素轉(zhuǎn)化過程的研究，初步判斷該菌群中含有能進(jìn)行硝化作用的亞硝化細(xì)菌、硝化細(xì)菌及能進(jìn)行硝酸鹽、亞硝酸鹽還原反應(yīng)的亞硝酸還原菌和硝酸鹽還原菌，這也進(jìn)一步解釋反應(yīng)過程中沒有硝酸鹽及亞硝酸鹽積累的脫氮現(xiàn)象。

以往對(duì)于好氧反硝化的研究主要停留在單一菌株的分離及特性的理論研究，且存在分離操作繁瑣困難、后期實(shí)際應(yīng)用性不高的問題。在實(shí)際應(yīng)用當(dāng)中，由于外界環(huán)境多變，單株菌的抵御外界沖擊能力有限，將導(dǎo)致氮素降解能力下降。而EM是一個(gè)強(qiáng)大的功能群體，各種微生物在其生長(zhǎng)過程中產(chǎn)生的有用物質(zhì)及分泌物，又將成為各自或相互間生長(zhǎng)的基質(zhì)和原料，通過這種相互作用、相互促進(jìn)起到協(xié)同的作用，代謝出抗氧化物質(zhì)，生成穩(wěn)定而復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)，抑制有害微生物的生長(zhǎng)繁殖和含硫、氮等惡臭物質(zhì)產(chǎn)生的臭味，，激活水中具有凈化水功能的原生動(dòng)物，利用微生物及水生植物的生物綜合效應(yīng)達(dá)到凈化廢水的目的［17］。

邵青等［18］專門做了EM脫除氨氮效果試驗(yàn)研究，結(jié)果為EM在好氧條件下能顯著提高污水中氨氮(NH+4—N)的去除率，在EM投入比例為0.8%時(shí)，去除率增幅達(dá)13.31%。孟范平［19］等人對(duì)高效復(fù)合菌技術(shù)處理生活污水進(jìn)行了研究，認(rèn)為在好氧條件下，當(dāng)菌液加入量為0.5%時(shí)，能顯著或極顯著提高污水氨態(tài)氮的硝化程度，增幅達(dá)37.62%。本研究應(yīng)用EM理論，用定向馴化的方法獲得有穩(wěn)定脫氮作用的有效生物群，以馴化代替篩選，提高實(shí)驗(yàn)效率。實(shí)驗(yàn)證明，該菌群在馴化第24天開始，氨氮去除率已穩(wěn)定在90%左右，具有單菌株所不及的穩(wěn)定的去除氨氮且無亞硝態(tài)氮和硝態(tài)氮積累的能力。

在菌群馴化過程中，了解微生物的群落結(jié)構(gòu)對(duì)馴化進(jìn)程的把握和今后對(duì)菌群的鑒定和分離處理系統(tǒng)中的優(yōu)勢(shì)菌種很重要。裘湛等［20］采用PCR－DGGE技術(shù)對(duì)處理采油廢水的水解酸化—缺氧法不同生物反應(yīng)器中污泥樣品進(jìn)行研究，確定了微生物的優(yōu)勢(shì)菌種，并進(jìn)行了多樣性分析，結(jié)果顯示在不同環(huán)境條件下微生物群落結(jié)構(gòu)的連續(xù)動(dòng)態(tài)變化過程。Curtis等［21］采用PCR－DGGE比較了不同污水處理廠的活性污泥中總微生物群落的多樣性。在以往的研究中，將PCR－DGGE圖譜作為菌群馴化的進(jìn)程標(biāo)準(zhǔn)的并不多見，并且對(duì)菌群馴化過程的檢測(cè)也只是針對(duì)一些理化指標(biāo)，沒有從種群構(gòu)成的分子生物學(xué)高度分析監(jiān)測(cè)整個(gè)馴化過程。本研究將PCR－DGGE技術(shù)與馴化各階段氮素去除指標(biāo)相結(jié)合，發(fā)現(xiàn)二者的變化是相吻合的，即在系統(tǒng)氨氮去除率保持相對(duì)穩(wěn)定的情況下，種群結(jié)構(gòu)也趨于穩(wěn)定。這說明將PCR－DGGE方法運(yùn)用到菌群馴化當(dāng)中是可行且有效的，也希望此方法在今后能得到更好的運(yùn)用。

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