錢志偉，孫新城

(1.河南農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院食品科學(xué)系，河南 鄭州 4 51450；2.鄭州輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450002)

食品中3種致病菌多重PCR檢測體系的建立及初步應(yīng)用

錢志偉1，孫新城2

(1.河南農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院食品科學(xué)系，河南 鄭州 4 51450；2.鄭州輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450002)

目的：建立同步速測食品中沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、單核細(xì)胞增生性李斯特菌的多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)方法。方法：利用基因組比對法尋找3種致病菌的特異性序列——沙門氏菌的invA基因、金黃色葡萄球菌的nuc基因和單增李斯特菌的prs基因，運用Primer Premier 5.0分別設(shè)計3對片段大小不同的特異性引物；通過優(yōu)化反應(yīng)體系，建立3種致病菌的多重PCR檢測體系。結(jié)果：建立的多重PCR方法靈敏度測試結(jié)果分別為7.6、3.8、5.1pg/μL，在此靈敏度下可以擴(kuò)增出全部特異性引物條帶，驗證性實驗結(jié)果出現(xiàn)相應(yīng)的目的條帶且未發(fā)生交叉影響。結(jié)論：初步建立能同步、簡便、快速、靈敏地檢測食品中沙門菌、金黃色葡萄球菌和單核細(xì)胞增生性李斯特菌的三重PCR方法。

食源性致病菌；多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)；沙門氏菌；金黃色葡萄球菌；單核細(xì)胞增生性李斯特菌；食品檢測

近年來，國內(nèi)外食品安全事件頻頻發(fā)生，其中由于病原微生物污染導(dǎo)致的食源性疾病最為常見。有資料統(tǒng)計，近10年來，在我國由微生物引起的食源性疾病事件中，沙門氏菌、金黃色葡萄球菌分別占17.9%和8.9%。在我國70%～80%的細(xì)菌食物中毒是由沙門氏菌引起的。單核細(xì)胞增生性李斯特菌污染食品引起的惡性中毒事件，在美國、墨西哥、法國多次發(fā)生，病死率達(dá)30%～70%[1-3]。因此，研究快速有效的沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和單核細(xì)胞增生性李斯特菌檢測和監(jiān)控方法，對于保證食品安全有著重要的意義。

傳統(tǒng)的致病菌檢驗，主要依靠常規(guī)的細(xì)菌學(xué)培養(yǎng)，存在著檢驗步驟繁瑣，周期長、特異性不強(qiáng)、靈敏度不高等問題，而且每次只能檢測出一種致病菌。有關(guān)致病菌檢測的乳膠凝集法、酶免疫測定法、酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbnent assay，ELISA)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)(polymerase chain reaction，PCR)、核酸雜交技術(shù)和生物傳感器技術(shù)因其特異性強(qiáng)、敏感性高、操作簡單快速得到廣泛應(yīng)用，但這些方法每次實驗通常也只能檢測一種病原細(xì)菌[4-5]，而食品通常存在多種病原菌多重混合污染，因此，近年來出現(xiàn)了許多同時檢測多種致病菌的快速和特異的檢測方法，多重PCR就是其中的一種[6]。多重PCR是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上改進(jìn)并發(fā)展起來的新型DNA擴(kuò)增技術(shù)，是在同一反應(yīng)體系中同時加入多對引物，并對多個特異性目的基因片段進(jìn)行同時擴(kuò)增，可對檢測對象中的多種細(xì)菌進(jìn)行同步檢測[7-9]。目前，針對對沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和單核細(xì)胞增生性李斯特菌快速檢測的現(xiàn)有報道中大多為單重擴(kuò)增或單個致病菌的多重擴(kuò)增，尚未見這3種致病同步檢測的報道[10-15]。

本研究分別以沙門氏菌的invA基因、金黃色葡萄球菌的nuc基因和單增李斯特菌的prs基因為靶基因，建立起同時檢測食品中沙門菌、金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌的多重PCR檢測方法，為食品中多種致病菌的快速檢測提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌O157∶H7 河南農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院食品科學(xué)系；乙型副傷寒沙門氏菌、單核細(xì)胞增生性李斯特菌、志賀氏菌、乙型溶血性鏈球菌由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)和鄭州大學(xué)惠贈。

DNA提取試劑盒、DL2000 DNA Ladder Marker、核酸回收試劑盒 TaKara寶生物工程(大連)有限公司；Taq酶、10×Buffer 美國Promega生物公司；PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成。

Eppendorf 離心機(jī)、PTC200梯度PCR儀、電泳儀美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 靶基因的選擇及引物設(shè)計

選擇3種致病菌的特異性保守基因[16-18]，即沙門氏菌的invA基因、金黃色葡萄球菌的nuc基因和單增李斯特菌的prs基因作為目的基因，用Primer Premier 5.0軟件分別設(shè)計3對片段大小不同、退火溫度接近的特異性引物，經(jīng)過GenBank的BLAST程序?qū)Ω饕锛皵U(kuò)增產(chǎn)物同源性進(jìn)行比對，確認(rèn)引物序列見表1。

表1 多重PCR引物序列Table 1 Sequences of multiple PCR primers

1.2.2 菌株培養(yǎng)與基因組DNA的提取

分別挑取沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌單菌落接種于LB培養(yǎng)基，37℃振蕩過夜培養(yǎng)?；蚪MDNA的抽提采用DNA提取試劑盒，按其操作說明進(jìn)行。用紫外分光光度計測定濃度，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 單重PCR檢測體系的建立

分別以3種菌株的基因組DNA為模板，進(jìn)行單重PCR，擴(kuò)增體系及參數(shù)：10×Buffer 2.5μL，25mmol Mg2+1.5μL，10mmol dNTP 0.3μL，50pmol的上下游引物0.1μL 5U/μL Taq酶0.5μL。94℃預(yù)變性5min后進(jìn)入循環(huán)，94℃ 50 s、53℃ 50 s、72℃ 50 s，35個循環(huán)，72℃延伸5min。擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，并送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。

1.2.4 引物特異性驗證

用3種引物分別擴(kuò)增枯草芽孢桿菌、大腸桿菌O157∶H7、乙型副傷寒沙門氏菌、志賀氏菌、乙型溶血性鏈球菌的基因組DNA，用2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。

1.2.5 三重PCR檢測體系建立及優(yōu)化

采用正交設(shè)計L16(44)在4個水平上進(jìn)行試驗來確定PCR反應(yīng)中4個因素(Taq酶、dNTPS、Mg2+、引物)的最佳水平，根據(jù)條帶的模糊程度、亮度差別以及含量，確定最佳多重PCR檢測體系。

1.2.6 三重PCR靈敏性驗證

將已測定濃度的3種菌的基因組DNA按10-1～10-5梯度進(jìn)行10倍稀釋后等體積混合，在最佳的多重PCR體系下進(jìn)行擴(kuò)增，觀察多重PCR擴(kuò)增的靈敏度。

1.2.7 人工模擬牛奶中3種菌檢測

分別將3株致病菌過夜培養(yǎng)，利用平板傾注法計數(shù)后，將3種菌組合感染(感染量約為1×107CFU/mL)牛奶，試劑盒提取DNA，用優(yōu)化好的PCR體系檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 模板DNA的初始濃度及純度

用紫外分光光度計分別檢測3種菌基因組DNA在260nm和280nm波長處的OD值，OD260/OD280都在1.7～1.8之間，純度達(dá)到要求；初始質(zhì)量濃度：沙門氏菌7.6μg/mL，金黃色葡萄球菌 3.8μg/mL，單增李斯特菌5.1μg/mL。

2.2 單重PCR擴(kuò)增

3種致病菌基因組DNA經(jīng)過單重PCR擴(kuò)增，用瓊脂糖凝膠電泳檢測，均擴(kuò)出目的條帶，擴(kuò)增產(chǎn)物回收經(jīng)上海生工測序，測序結(jié)果用DNA s ister軟件分析和GenBank的BLAST 比對程序進(jìn)行比對，與GenBank上公布的序列相似性很高(99%)，說明此次擴(kuò)增的目的基因，引物特異性強(qiáng)。擴(kuò)增圖見圖1。

圖1 單重PCR擴(kuò)增實驗結(jié)果Fig.1 Results of single PCR amplification

2.3 引物特異性驗證

圖2 特異性驗證實驗結(jié)果Fig.2 Specificity of the primers of Salmonella spp., Staphylococcus aureus and Listeria monocytogenes

用3種引物分別擴(kuò)增其他5種致病菌的基因組DNA，用引物相對應(yīng)的基因組DNA做陽性對照，無菌生理鹽水做陰性對照。只有陽性對照擴(kuò)增出目的片段，其他5種致病菌沒有擴(kuò)增出目的片段，說明3對引物特異性較好。擴(kuò)增結(jié)果見圖2。

2.4 多重PCR檢測體系建立

通過正交試驗L16(44)，確定25mmol Mg2+1.2μL，10mmol dNTPS 0.6μL，50pmol的上下游引物 0.2μL，5U/μL Taq酶1.5μL為最優(yōu)條件。最優(yōu)條件擴(kuò)增結(jié)果見圖3。

圖3 多重PCR擴(kuò)增實驗結(jié)果Fig.3 Results of multiplex PCR amplification

2.5 多重PCR靈敏性驗證

分別將10倍梯度稀釋的3種食源性致病菌的基因組DNA等體積混合，用優(yōu)化的多重PCR體系進(jìn)行擴(kuò)增檢測，3種菌分別能檢測到：沙門氏菌7.6pg/μL，金黃色葡萄球菌3.8pg/μL，單增李斯特菌5.1pg/μL。本方法研究的多重PCR靈敏度為101pg，在此靈敏度下可以擴(kuò)增出全部特異性引物條帶，結(jié)果如圖4所示。

圖4 多重PCR的靈敏度實驗結(jié)果Fig.4 Sensitivity of the multiplex PCR method

2.6 模擬實驗驗證

3種食源性致病菌組合后人工感染牛奶，進(jìn)行多重PCR檢測，結(jié)果出現(xiàn)相應(yīng)的目的條帶并且未發(fā)生交叉影響，從而證明該多重PCR檢測體系具有較好的穩(wěn)定性和一定的實用價值，結(jié)果如圖5所示。

圖5 多重PCR的驗證實驗結(jié)果Fig.5 Validation of the multiplex PCR method

3 討 論

多重PCR是在單重PCR基礎(chǔ)發(fā)展起來的檢測方法，它在同一反應(yīng)中使用多套引物同時擴(kuò)增多種待測靶基因。應(yīng)用多重PCR技術(shù)檢測致病菌基因，簡化了單重PCR研究所需要的繁雜的實驗操作，使得一次反應(yīng)檢測多個項目成為可能，目前該技術(shù)已被廣泛的用于食品中致病菌的檢測。

目的基因的篩選對PCR的特異性非常重要，同時由于不同引物之間的解鏈溫度不同，所以找到一個適合所有引物的解鏈溫度在多重PCR中也顯得十分重要。所以本研究選取沙門氏菌的invA基因、金黃色葡萄球菌的nuc基因和單增李斯特菌的prs基因作為目的基因來設(shè)計引物，這3個序列均為目的菌的高度保守序列，特異性強(qiáng)，可作為基因檢測和鑒定的依據(jù)。

多重PCR擴(kuò)增時，任何一種試驗條件控制不當(dāng)，都將很容易導(dǎo)致非特異性的產(chǎn)物甚至擴(kuò)增失敗[19-21]。本研究通過設(shè)計在一定范圍內(nèi)的L16(44)正交試驗優(yōu)化了多重PCR反應(yīng)體系，找到合適的配比關(guān)系，實現(xiàn)了3種病原菌的同時檢測。

本研究建立的多重PCR檢測方法，可同時檢測食源性致病菌沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌，同時擴(kuò)增出3條大小不同的目的片段，并且有很強(qiáng)的特異性；而且快速準(zhǔn)確、簡便、靈敏度高；可為進(jìn)入實際臨床檢測提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持，具有一定的應(yīng)用價值。

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Establishment and Application of a Multiplex PCR Assay for Detection of Three Pathogenic Bacteria in Food

QIAN Zhi-wei1，SUN Xin-cheng2
(1. Department of Food Science, Henan Vocational College of Agriculture, Zhengzhou 451450, China；2. School of Food and Biological Engineering, Zhengzhou University of Light Industry, Zhengzhou 450002, China)

Objective∶ To develop a rapid multiplex polymerase chain reaction (m-PCR) assay for simultaneous detection of Salmonella spp., Staphylococcus aureus and Listeria monocytogenes in food. Methods∶ The genomic alignment method was used to identify specific PCR target sequences. Three pairs of specific primers were designed with Primer Premier 5.0 according to the invasive protein gene (invA) of Salmonella, the nuc gene of Staphylococcus aureus and the prs gene of Listeria monocytogen. Multiplex PCR was established by optimizing the reaction system. Results∶ The sensitivity of the multiplex PCR method was 7.6 pg/μ L for Salmonellla spp., 3.8 pg/μ L for Staphylococcus aureus, and 5.1 pg/μL for Listeria monocytogenes. All specific primers were amplified, and their corresponding strips were observed in validation experiments without cross reactivity. Conclusions∶ A triple PCR assay has been established for the simultaneous, sample, rapid and sensitive detection of Salmonella spp., Staphylococcus aureus and Listeria monocytogenes in food.

food-borne pathogenic bacteria；multiplex polymerase chain reaction (m-PCR)；Salmonella spp.；Staphylococcus aureus；Listeria monocytogen；food inspection

TS207.4

A

1002-6630(2011)16-0236-04

2010-11-17

河南省科技廳重點攻關(guān)項目(102102310093)

錢志偉(1969—)，男，副教授，碩士，研究方向為食品安全與質(zhì)量控制。E-mail：qzwhnac@126.com

*通信作者：孫新城(1977—)，男 ，講師，碩士，研究方向為病毒學(xué)及食品安全檢測。E-mail：biosxc@126.com