田金強，蘭彥平，王春艷，王 強，周連第,*

(1.北京市農(nóng)林科學(xué)院農(nóng)業(yè)綜合發(fā)展研究所，北京 100097；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京 100093)

功能栗仁的酶法制備及功能評價

田金強1,2，蘭彥平1，王春艷2，王 強2，周連第1,*

(1.北京市農(nóng)林科學(xué)院農(nóng)業(yè)綜合發(fā)展研究所，北京 100097；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京 100093)

對完整形態(tài)的板栗仁進行酶解，使之含有功能性短肽，以強化或者賦予其保健功能，擬開發(fā)出具有降血壓和抗氧化活性的功能栗仁產(chǎn)品。主要對功能栗仁制備的關(guān)鍵技術(shù)進行研究，包括蛋白酶的選擇、酶解條件的優(yōu)化、酶解后栗仁的功能評價等。結(jié)果表明：采用木瓜蛋白酶酶解可得到較高的短肽得率和水解度；木瓜蛋白酶與α-淀粉酶復(fù)合可提高短肽得率；木瓜蛋白酶和其他蛋白酶復(fù)合可提高水解度，其中與Flowryme復(fù)合水解度提高最為明顯；蛋白酶用量過低或過高均不利于酶解反應(yīng)進行；α-淀粉酶(Liquozyme Supra)的適宜用量為0.35g/100mL蛋白酶液，木瓜蛋白酶和Flowryme適宜的配比為2∶1(m/m)，蛋白酶的適宜用量為8000U/g，當(dāng)酶解溫度55℃、酶解時間15h時，短肽得率為43.62%、水解度為26.27%；板栗水解物具有較好的ACE(血管緊張素轉(zhuǎn)化酶)抑制和抗氧化活性，ACE抑制的IC50為4.70mg/mL，亞油酸氧化抑制的IC50值為4.26mg/mL，清除超氧陰離子自由基、羥自由基和DPPH自由基的IC50值分別為2.77、7.78、4.30mg/mL。

板栗仁；功能食品；短肽；ACE抑制；抗氧化

板栗原產(chǎn)于我國，已有3000多年的栽培歷史，素有“木本糧食”、“鐵桿莊稼”、“干果之王”等美譽[1]。近十年來，我國板栗生產(chǎn)發(fā)展迅猛。2000年我國板栗年產(chǎn)量為59.8萬t，2003年達71.5萬t，到2007年已有25個省市栽培，面積達到2000萬畝(約130萬公頃)，產(chǎn)量突破120萬t，占世界總產(chǎn)量的70%，面積及產(chǎn)量均居世界之首[2]。板栗富有營養(yǎng)、保健和醫(yī)療功能，含有40%～60%淀粉、5%～10%蛋白質(zhì)以及少量脂肪、胡蘿卜素、酚類物質(zhì)、多種維生素如VC、VA、VB和礦物元素等[3-4]。中外醫(yī)學(xué)認為板栗味甘、性溫，有補腎健脾、強身壯骨、益胃平肝和防止心血管疾病等保健醫(yī)療功能[5-6]。

食品功能化是食品加工的發(fā)展方向之一。板栗當(dāng)中含有5%～10%的蛋白質(zhì)，在保持板栗仁完整形態(tài)的前提下，采用蛋白酶將以上蛋白質(zhì)水解為具有生物活性的短肽，以強化或者賦予板栗某些保健功能，開發(fā)出功能栗仁產(chǎn)品，無疑是一條板栗精深加工的新思路。國內(nèi)功能食品的產(chǎn)品形態(tài)多是藥劑形態(tài)，如膠囊、片劑、口服液，忽視了其食品屬性。功能食品的發(fā)展方向趨向于以食品作為載體，而非以藥劑的形式出現(xiàn)。功能栗仁以完整的板栗仁作為載體、強化或賦予其某些保健功能，既迎合功能食品的發(fā)展方向，也符合人們對板栗的消費習(xí)慣(我國習(xí)慣板栗整粒食用)，同時無需進行功能因子的分離提純，加工成本大大降低。本實驗主要對功能栗仁制備的關(guān)鍵技術(shù)進行研究，包括蛋白酶的選擇、酶解條件的優(yōu)化和酶解后栗仁的功能活性等。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

燕紅板栗產(chǎn)于北京懷柔區(qū)；純凈水 杭州哇哈哈集團。

Alalase蛋白酶(6.119×105U/mL)、Protamex蛋白酶(2.159×105U/g)、Neutrase蛋白酶(3.6168×105U/mL)、Flowryme蛋白酶(5.477×104U/g)、N120p蛋白酶(2.775× 105U/g)、木瓜蛋白酶(4.342×104U/g)、Liquozyme Supra α-淀粉酶(90KNU/g)、切枝淀粉酶(400PUN/mL) 丹麥諾維信公司；福林-酚試劑、二苯代苦味酰自由基(DPPH)、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(angiotension-converting enzyme，ACE)、馬尿酰組胺酰亮氨酸(HHL) 美國Sigma公司；鄰苯三酚、水楊酸、TBHQ 北京化學(xué)試劑公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

LGJ-25型冷凍干燥機 北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司；HZC-250恒溫振蕩培養(yǎng)箱 太倉市實驗設(shè)備廠；TU-1901雙光束紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限公司；高效液相色譜儀、2695色譜工作站(四元泵、柱溫箱、自動進樣器、在線脫氣機)、2998二極管陣列檢測器 美國Waters公司。

1.3 功能栗仁制備的工藝路線及操作要點

工藝流程：板栗→剝殼去衣→干制→浸漬酶液→瀝干→培養(yǎng)→裝袋→滅酶及殺菌→產(chǎn)品。

操作要點：將新鮮的板栗在沸水中加熱2min，趁熱手工剝殼去衣之后，浸入護色液中浸泡30min，護色液成分為0.01%茶多酚＋0.2%檸檬酸＋0.1% EDTA＋2% NaCl＋2%無水乙醇[7]，以達到防褐變并破壞栗仁表面致密層的目的，之后進行冷凍干燥。將干燥后的栗仁浸入酶液中浸漬2h使干栗仁復(fù)水，取出瀝干，然后在適宜的溫度下培養(yǎng)。裝入耐高溫鋁箔袋，封口，121℃處理15min進行滅酶及殺菌。

1.4 酶解條件的確定

1.4.1 蛋白酶的選擇

分別選用Alalase、Protamex、Flowryme、N120p、Neutrase和木瓜蛋白酶，控制栗仁蛋白水解時的酶用量為6000U/g，具體操作方法：配制一定酶含量的酶液(干栗仁浸入酶液中浸漬2h后復(fù)水，可吸收干栗仁等量的酶液，由此可計算所配制酶液的酶含量)，將干栗仁在酶液中浸漬2h，取出瀝干后恒溫培養(yǎng)5h，6種蛋白酶培養(yǎng)溫度依次為55、50、50、55、50、55℃，測定短肽得率(trichloroacetic acid-nitrogen solution index，TCA-NSI)與水解度(degree of hy drolysis，DH)。

1.4.2 提高短肽得率方法的研究(蛋白酶與淀粉酶的復(fù)合處理)

按蛋白加酶量為6000U/g配制木瓜蛋白酶液，將酶液分成兩份，分別添加α-淀粉酶和切枝淀粉酶，添加量為0.25g/100mL酶液。將干栗仁浸入酶液中浸漬2h復(fù)水，取出瀝干后55℃恒溫培養(yǎng)15h，測定短肽得率和水解度。

1.4.3 提高水解度方法的研究(復(fù)合蛋白酶處理)

木瓜蛋白酶以1∶1的質(zhì)量比分別復(fù)合Alalase、Protamex、Neutrase、Flowryme和N120p蛋白酶，均按6000U/g的蛋白加酶量配制復(fù)合酶液，干栗仁在此酶液中浸漬2h后瀝干，55℃恒溫培養(yǎng)5h之后，測定短肽得率和水解度。

1.4.4 蛋白酶用量的確定

按2000、4000、6000、8000、10000、12000、14000、16000U/g的蛋白加酶量配制不同濃度的木瓜蛋白酶和Flowryme蛋白酶混合液(2∶1，m/m)，分別加入0.35g/100mL酶液的α-淀粉酶，將干栗仁浸入酶液中浸漬2h復(fù)水，取出瀝干后55℃培養(yǎng)15h，測定短肽得率及水解度。

1.5 栗仁功能活性的測定

1.5.1 ACE抑制活性的測定

1.5.1.1 色譜條件

色譜柱：SunFireTMC18分析型色譜柱(4.6mm× 250mm，5μm)；檢測波長：228nm；流速：0.4mL/ min；流動相A為純凈水(含0.05%三氟乙酸)，流動相B為色譜乙腈(含0.05%三氟乙酸)；進樣量：20μL，自動進樣；柱溫3 0℃。

1.5.1.2 試劑與供試品溶液的制備

ACE溶液：將1U ACE溶于2mL 0.1mol/L硼酸緩沖液(pH8.3，含0.4mol/L NaCl)中即得；HHL溶液：取HHL適量，以0.1mol/L硼酸緩沖液(pH 8.3，含0.4mol/L NaCl)溶解配成5mmol/L HHL溶液；馬尿酸標(biāo)準(zhǔn)液的制備：取馬尿酸標(biāo)準(zhǔn)品適量，用0.1mol/L硼酸緩沖液(pH8.3，含0.4mol/L NaCl)配制成不同濃度的馬尿酸標(biāo)準(zhǔn)液；栗仁水解樣品的制備：將培養(yǎng)后的栗仁研磨粉碎，加入適量去離子水和玻璃珠，50℃、140r/min搖床振蕩1h，之后4000r/min 離心10min，取上清液冷凍干燥即得到栗仁短肽粗品，取一定量的栗仁短肽，用0.1mol/L硼酸緩沖液(pH8.3，含0.4mol/L NaCl)溶解混勻，配制成不同濃度的溶液，4℃保存?zhèn)溆?；HPLC分析：取不同濃度的栗仁短肽樣品15μL，加入15μL的ACE溶液，在37℃水浴保溫3min后加入50μL HHL溶液開始反應(yīng)，在37℃條件下反應(yīng)30min后加入100μL 1.0mol/L HCl溶液終止反應(yīng)，同時用15μL pH8.3硼酸緩沖液替代栗仁短肽樣品溶液，作為空白對照組。反應(yīng)液經(jīng)0.45μm濾膜過濾后用于HPLC分析。

1.5.1.3 ACE抑制率的計算

式中：a為空白組馬尿酸的峰面積；b為樣品組馬尿酸的峰面積。

1.5.2 抗氧化活性的測定

對超氧陰離子自由基、羥自由基和DPPH自由基的清除活性的測定參照文獻[8]；亞油酸氧化抑制力的測定參照文獻[9]。

1.6 分析方法

還原糖的測定：參照GB/T 5009.7—2008《食品中還原糖的測定》；短肽得率的測定：參照三氯乙酸(TCA)可溶性氮法[10]；水解度的測定：參照鄰苯二甲醛法(OPA)[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解條件的確定

2.1.1 蛋白酶的選擇

圖1 不同蛋白酶作用下的短肽得率(A)和水解度(B)測定結(jié)果Fig.1 Effect of protease type on short-chain peptide yield (A) and DH (B)

由圖1A可知，選用木瓜蛋白酶短肽得率最高，可達到28.23%，使用Neutrase蛋白酶得率最低，僅為12.85%，其他4種蛋白酶差異不大，均在19%左右，短肽得率從高到低的順序依次為木瓜蛋白酶、Protamex、N120p、Alalase、Flowrymase、Neutrase。由圖1B可知，選用木瓜蛋白酶水解度最高，為17.39%，6種蛋白酶水解度由高到低的順序為木瓜蛋白酶、Flowrymase、Alalase、N120p、Protamex、Neutrase。綜合考慮短肽得率和水解度兩個因素，確定木瓜蛋白酶為較適宜的蛋白酶。

2.1.2 提高短肽得率的方法

功能栗仁制備中存在短肽得率相對較低的問題，原因是酶和底物在固態(tài)的栗仁中擴散比較困難。采用蛋白酶與淀粉酶共同作用，結(jié)果如表1所示。

表1 蛋白酶-淀粉酶復(fù)合后短肽得率Table 1 Effect of papain alone and in combination withα-amylase or pullulanase on short-chain peptide yield

由表1可知，α-淀粉酶能促進蛋白酶解反應(yīng)，提高短肽得率，較對照提高約3%，而切枝淀粉酶則有抑制作用，較對照降低約6%。α-淀粉酶之所以對短肽得率有促進作用，是因為α-淀粉酶能水解淀粉α-1,4糖苷鍵，將大分子淀粉水解成分子質(zhì)量較小的糊精，一定程度上消除了擴散限制。而切枝淀粉酶將支鏈淀粉水解為直鏈淀粉，使栗仁中淀粉的結(jié)晶化和凝膠化趨勢增強[12]，不利于體系中的蛋白酶與底物的充分接觸，因此對酶解反應(yīng)有抑制作用。

相同操作條件下添加不同量的α-淀粉酶，栗仁中還原糖含量和短肽得率如圖2所示。從圖2可看出，當(dāng)α-淀粉酶的添加量為0.35g/100mL酶液時，還原糖含量最高，達到14.53g/100g，意味著α-淀粉酶對板栗淀粉的水解程度達到最大，同時短肽得率亦達到最高，為49.95%。

圖2 不同α-淀粉酶用量的還原糖含量和短肽得率Fig.2 Effect ofα-amylase amount on reducing sugar content and short-chain peptide yield

因此，功能栗仁的制備，應(yīng)使淀粉適度水解后再進行蛋白酶解。換一個角度，這也是防止板栗制品“淀粉返生”的必要措施[13-14]。在實際生產(chǎn)中，可利用板栗內(nèi)源α-淀粉酶的作用使淀粉適度水解，即新鮮板栗冷藏1～2月后再加工[15]。

2.1.3 提高水解度的方法

通常，具有較好降壓活性的肽類分子質(zhì)量在5000D以下[16]，較好抗氧化活性的肽類為2500～3000D，甚至更低[17-18]。因此一定范圍內(nèi)水解度越高越好。采用木瓜蛋白酶與其他蛋白酶共同作用，水解度測定結(jié)果如表2所示。

表2 木瓜蛋白酶與其他蛋白酶復(fù)合的水解度和短肽得率Table 2 Effect of papain alone and in combination with other five proteases on short-chain peptide yield and DH

由表2可知，木瓜蛋白酶與其他蛋白酶復(fù)合可提高水解度。尤其是與Flowryme復(fù)合，水解度達到25.11%，明顯高于單獨使用木瓜蛋白酶時的1 7.3 9%。除與Neutrase復(fù)合的水解度低于單獨使用木瓜蛋白酶外，與其他酶復(fù)合水解度均有提高。這是由于不同蛋白酶的酶切位點不同，不同的蛋白酶水解不同肽鍵，效果相互疊加。復(fù)合酶作用下水解度由高到低依次為：木瓜蛋白酶＋Flowryme＞木瓜蛋白酶＋Alalase＞木瓜蛋白酶＋Protamex＞木瓜蛋白酶＋N120p＞木瓜蛋白酶＞木瓜蛋白酶＋Neutrase。不難推知，F(xiàn)lowryme的酶切位點與木瓜蛋白酶差異較大，致使水解度提高最為明顯。而與Neutrase復(fù)合水解度低于木瓜蛋白酶，可能是因為水解能力較弱的Neutrase對木瓜蛋白酶存在競爭性抑制作用的緣故。但木瓜蛋白酶與其他蛋白酶共同作用時，短肽得率均低于木瓜蛋白酶的單一酶(表2)。

圖3 不同木瓜蛋白酶與Flowryme配比的短肽得率(A)和水解度(B)Fig.3 Effect of papain-to-Flowryme ratio on short-chain peptide yield (A) and DH (B)

相同操作條件下，控制木瓜蛋白酶與Flowryme的不同配比，短肽得率和水解度的變化結(jié)果如圖3所示。可以看出，隨著木瓜蛋白酶所占比例的降低，短肽得率一直呈下降趨勢，但水解度呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，木瓜蛋白酶與Flowryme配比在2∶1時水解度達到最大值，低于或高于該配比水解度均有降低。綜合考慮短肽得率和水解度，確定木瓜蛋白酶與Flowryme適宜的配比為2∶1。

2.1.4 蛋白酶用量的確定

圖4 不同蛋白酶用量時的短肽得率和水解度Fig.4 Effect of protease dosage on short-chain peptide yield and DH

由圖4可知，短肽得率隨著蛋白酶用量的增加而增加，當(dāng)?shù)鞍酌赣昧窟_到10000U/g時，短肽得率達到最高值為45.20%。酶用量繼續(xù)增加短肽得率反而下降，這是由于盡管加酶量相對增加，但能夠發(fā)生反應(yīng)的有效酶量卻保持不變，即所謂的“酶飽和”現(xiàn)象，過多的酶可抑制酶和底物的擴散。水解度隨酶用量的變化亦呈相似趨勢，當(dāng)?shù)鞍酌赣昧繛?000U/g時水解度最高為26.27%。綜合考慮短肽得率和水解度，確定蛋白酶的適宜用量為8000U/g，此時短肽得率為43.62%、水解度為26.27%。

2.2 功能活性的測定

2.2.1 ACE抑制活性的測定

圖5 HHL與ACE反應(yīng)后的色譜分析圖Fig.5 HPLC chromatograms of reaction products between HHL and ACE without inhibition or in the attendance of short-chain peptides derived from Chinese chestnut kernels

對比圖5A與5B可知，板栗短肽粗品具有較好的ACE抑制活性(馬尿酸的出峰時間在4.485min處)。其活性隨著肽質(zhì)量濃度的增加呈線性增加趨勢，ACE抑制的IC50為4.70mg/mL(圖6)。

圖6 不同質(zhì)量濃度栗仁短肽的ACE抑制活性Fig.6 Linear concentration dependence of ACE inhibitory activity of short-chain peptides derived from Chinese chestnut kernels

2.2.2 抗氧化活性的測定

圖7 不同質(zhì)量濃度栗仁短肽的自由基清除和抗氧化活性效果Fig.7 Linear concentration dependence of radical scavenging and antioxidant activities of short-chain peptides derived from Chinese chestnut kernels

由圖7可知，栗仁短肽粗品具有較強的超氧陰離子自由基、羥自由基、DPPH自由基清除活性以及亞油酸氧化抑制活性，并且隨著質(zhì)量濃度增加，其清除或抗氧化作用增強。栗仁短肽清除以上3種自由基的IC50值分別為2.77、7.78、4.30mg/mL，亞油酸氧化抑制的IC50值為4.26mg/mL。

3 討 論

蛋白酶酶解制備的功能栗仁制品，外觀呈褐色、質(zhì)地肉糯、栗香濃郁、香甜中帶有一點苦味，這是由于含有疏水性肽(苦味肽)的緣故，因此蛋白酶對栗仁風(fēng)味的影響較小。如前所述，α-淀粉酶能提高短肽得率、防止制品的“淀粉返生”。但α-淀粉酶處理使栗仁稍微帶有酶本身不愉快的嗅味，因此在實際生產(chǎn)中最好利用內(nèi)源α-淀粉酶的作用，即新鮮板栗冷藏1～2月后再加工。

蛋白酶均勻滲入栗仁組織內(nèi)是制備功能栗仁的關(guān)鍵，本實驗采用栗仁干制后浸漬酶液的方法取得了較好的滲入效果。而栗仁的干制，包括熱風(fēng)干燥、冷凍干燥等均為生產(chǎn)中成熟的技術(shù)，因此本實驗的工藝產(chǎn)業(yè)化沒有困難。此外，栗仁漂燙后浸入酶液也可以使蛋白酶均勻滲入，若采用此工藝可降低生產(chǎn)成本。

本研究表明，采用木瓜蛋白酶和Flowryme復(fù)合對完整形態(tài)的板栗仁進行酶解，可賦予板栗仁ACE抑制、抗氧化和自由基清除活性，這為開發(fā)具有降血壓、抗氧化活性的功能栗仁產(chǎn)品奠定了基礎(chǔ)。下一步研究將對酶解工藝及其參數(shù)進一步優(yōu)化，并借鑒軟包裝栗仁罐頭的加工工藝，開發(fā)出色香味形俱佳的功能栗仁產(chǎn)品。

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Enzymatic Preparation and Biological Activities of Functional Chinese Chestnut Kernel Products

TIAN Jin-qiang1,2，LAN Yan-ping1，WANG Chun-yan2，WANG Qiang2，ZHOU Lian-di1,*
(1. Institute of Agricultural Integrated Development, Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences, Beijing 100097, China；2. Institute of Agro-products Processing Science and Technology, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100093, China)

Intact Chinese chestnut kernels were enzymatically hydrolyzed to develop functional products with antihypertensive and antioxidant activities. Enzyme screening was investigated for different purposes. Papain could result in higher shortchain peptide yield and degree of hydrolysis (DH) than other five proteases investigated. A higher short-chain peptide yield was obtained by papain + α-amylase than papain + pullulanase and papain alone. Compared with papain alone, the combination of papain and each of the other five proteases increased the DH of Chinese chestnut kernels, especially in combination with Flowryme. Improper protease amount was unfavorable for the hydrolysis of Chinese chestnut kernels. The appropriate amount of α-amylase was 0.35 g/100 mL hydrolysate. The appropriate ratio of papain to Flowryme was 2∶1 (m/m). The DH of Chinese chestnut kernels was 26.27% and the short-chain peptide yield was 43.62% under the following hydrolysis conditions∶ protease amount of 8000 U/g protein, hydrolysis temperature of 55 ℃ and hydrolysis time of l5 h. The resultant hydrolysate exhibited excellent ACE inhibitory activity with an IC50of 4.70 mg/mL and antioxidant activity. The IC50vales for inhibiting linoleic acid oxidation and scavenging superoxide anion, hydroxyl, DPPH free radicals were 4.26, 2.77, 7.78 mg/mL and 4.30 mg/mL, respectively.

chestnut kernel；functional food；peptide；ACE inhibition；antioxidation

TS218

A

1002-6630(2011)16-0146-06

2011-03-01

田金強(1971—)，男，副教授，博士，研究方向為食品生物技術(shù)。E-mail：tianjinqiang1971@163.com

*通信作者：周連第(1963—)，男，研究員，博士，研究方向為農(nóng)藝經(jīng)濟和農(nóng)業(yè)發(fā)展。E-mail：liandizhou@126.com