梁先長(zhǎng)，李加興，田向榮，胡平平，黃壽恩，黃 誠(chéng)*

(1.林產(chǎn)化學(xué)加工工程湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 吉首 416000；2.吉首大學(xué)生物資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，湖南 吉首 416000；3.中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410004；4.吉首大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，湖南 吉首 416000)

尿素包合法純化火棘籽油亞油酸與鯊烯工藝

梁先長(zhǎng)1，李加興1，田向榮2，胡平平3，黃壽恩3，黃 誠(chéng)4,*

(1.林產(chǎn)化學(xué)加工工程湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 吉首 416000；2.吉首大學(xué)生物資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，湖南 吉首 416000；3.中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410004；4.吉首大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，湖南 吉首 416000)

以火棘籽油為原料，采用尿素包合法對(duì)其亞油酸進(jìn)行純化，并在此基礎(chǔ)上通過柱層析分離出鯊烯。通過單因素試驗(yàn)、正交試驗(yàn)和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(gas chromatography-mass spectroscopy，GC-MS)分析方法，研究尿素包合過程中包合時(shí)間、包合溫度及火棘籽油、尿素和乙醇之間的配比等因素對(duì)亞油酸純度和回收率的影響。結(jié)果表明：火棘籽油在原料∶尿素∶乙醇＝1∶2∶6(g/g/mL)、-5℃條件下包合12h，其亞油酸純度從38.40%提高到68. 55%，回收率達(dá)72.23%；純化后的火棘籽油再經(jīng)柱層析分離得到鯊烯，純度達(dá)98.16%。

火棘；尿素包合法；亞油酸；柱層析；鯊烯；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)

亞油酸是人體所需的必需脂肪酸，具有降低人體血清膽固醇含量、預(yù)防粥樣動(dòng)脈硬化、降血壓作用，對(duì)機(jī)體代謝起著重要的調(diào)節(jié)作用[1-3]。而制備純度較高的亞油酸，則是研究和開發(fā)共軛亞油酸的基礎(chǔ)，共軛亞油酸是亞油酸的立體和位置異構(gòu)體混合物的總稱，是一種很強(qiáng)的抗癌物質(zhì)，具有抗動(dòng)脈粥樣化形成、抗糖尿病、抗過敏、調(diào)節(jié)免疫、促進(jìn)生長(zhǎng)等生理功能[4-8]。鯊烯是一種重要的生物活性物質(zhì)，具有抗疲勞、抗心血管疾病、抗感染，以及一定的抗癌、防癌及保濕養(yǎng)顏的作用，因此廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥和化妝品等眾多行業(yè)[2,9-13]。

尿素包合法是分離純化飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸以及多不飽和脂肪酸的有效方法，目前已實(shí)現(xiàn)了商業(yè)化[14]，應(yīng)用于多種植物油中[15-18]，但在火棘籽油中的應(yīng)用國(guó)內(nèi)未見報(bào)道。此法工藝簡(jiǎn)單，便于操作，溶劑可以回收利用，成本低，且純化的多不飽和脂肪酸純度較高，是分離純化多不飽和脂肪酸的理想方法。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)尿素包合法純化火棘籽油中亞油酸及柱層析分離鯊烯的主要工藝條件進(jìn)行系統(tǒng)的研究，將為亞油酸和鯊烯的進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原料為采用溶劑法提取的火棘籽油[19]；硅膠H(粒度100～200目)、硅膠G254 青島海洋化工集團(tuán)；乙醚、石油醚、無水乙醇、氫氧化鉀、氯化鈉、無水硫酸鈉、尿素等均為分析純；正己烷、無水甲醇為色譜純。

1.2 儀器與設(shè)備

RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；TMP-2型上皿式電子天平 湘儀天平儀器設(shè)備有限公司；DSY-2-4孔恒溫水浴鍋 北京國(guó)華醫(yī)療器械廠；MDF-192型冷凍機(jī) 日本三洋公司； DZF-6050型真空干燥箱 上海博訊事業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵 浙江黃巖求精真空泵廠；QP2010型氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 操作要點(diǎn)

將尿素與乙醇按一定比例混合，在70℃旋轉(zhuǎn)回流至尿素全部溶解，加入一定量原料，于80℃回流30min，冷卻到室溫，控制包合溫度反應(yīng)一段時(shí)間后，對(duì)包合物減壓抽濾，濾液在85℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收乙醇，依次用飽和氯化鈉、1mol/L鹽酸和蒸餾水洗滌，加入正己烷進(jìn)行萃取分層，合并有機(jī)相，濃縮回收正己烷，干燥后即得到純化后的亞油酸，計(jì)算亞油酸的回收率；將活化后的硅膠采用濕法裝柱、濕法上樣(樣品為純化后的脂肪酸)，選擇乙醚∶石油醚＝1∶6(V/V)作為洗脫劑進(jìn)行洗脫，保持洗脫速度為1滴/s，每隔3min收集一次，依次編號(hào)，將收集的產(chǎn)物甲酯化后采用GC-MS檢測(cè)鯊烯。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

1.3.2.1 包合時(shí)間對(duì)亞油酸純化效果的影響

采用乙醇∶尿素4∶1(mL/g)、尿素∶原料4∶1(g/g)、包合溫度5℃的條件，對(duì)火棘籽油分別處理4、6、8、10、12、14h，以亞油酸純度和回收率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，探討適宜的包合時(shí)間。

1.3.2.2 乙醇與尿素比對(duì)亞油酸純化效果的影響

采用尿素∶原料4∶1(g/g)、包合溫度5℃、乙醇∶尿素為1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1(mL/g)的條件，分別對(duì)火棘籽油包合12h，以亞油酸純度和回收率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，探討適宜的乙醇與尿素配比。

1.3.2.3 包合溫度對(duì)亞油酸純化效果的影響

采用乙醇與尿素比3∶1(mL/g)、尿素與原料比3∶1 (g/g)，包合溫度為-15、-10、-5、0、5、10℃的條件，分別對(duì)火棘籽油包合12h，以亞油酸純度和回收率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，探討適宜的包合溫度。

1.3.2.4 尿素與原料比對(duì)亞油酸純化效果的影響

采用乙醇∶尿素3∶1(mL/g)、包合溫度-5℃，尿素∶原料為1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1(g/g)的條件，分別對(duì)火棘籽油包合12h，以亞油酸純度和回收率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，探討適宜的尿素用量。

1.3.3 尿素包合法純化火棘籽油中亞油酸工藝優(yōu)化

通過單因素試驗(yàn)結(jié)果，確定包合時(shí)間、乙醇∶尿素、包合溫度和尿素∶原料4個(gè)因素是影響亞油酸純化效果的主要因素，故以此4因素設(shè)計(jì)L9(34)正交試驗(yàn)，以亞油酸純度和回收率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，優(yōu)化提取工藝。試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素水平見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels in orthogonal array design

1.4 分析評(píng)價(jià)方法

1.4.1 純度分析

采用GC-MS法分析檢測(cè)，面積歸一法計(jì)算純度。

1.4.1.1 原料甲酯化處理[20]

采用KOH-甲醇法。吸取0.5mL火棘籽油于25mL具塞試管中，加入3mL正己烷溶解，再加入2mL甲醇和2mL 1mol/L KOH-甲醇溶液，振蕩，于60℃水浴30min，冷卻，加入2mL飽和NaCl溶液，靜置10min分層，取上清液進(jìn)行GC-MS分析。

1.4.1.2 色譜條件

Rtx-5MS色譜柱(30m×0.32mm，0.25μm)；載氣：He(99.99%)；進(jìn)樣量：0.5μL；進(jìn)樣方式：分流進(jìn)樣，分流比：20∶1；流速：1.0mL/min；進(jìn)樣溫度：250℃；色譜-質(zhì)譜接口溫度：230℃；程序升溫：100℃(保持2min)，以4℃/min升溫至250℃并保持2min。

1.4.1.3 質(zhì)譜條件

離子源：EI離子源；電子能：70eV；接口溫度：230℃；離子源溫度：200℃；質(zhì)量掃描范圍：m/z29～450。

1.4.2 亞油酸回收率計(jì)算

2 結(jié)果與分析

2.1 包合時(shí)間對(duì)亞油酸純化效果的影響

圖1 包合時(shí)間對(duì)亞油酸純化效果的影響Fig.1 Effect of adduction time on purity of linoleic acid

由圖1可知，隨著包合時(shí)間的延長(zhǎng)，亞油酸純度隨之升高，回收率有所下降；當(dāng)包合時(shí)間達(dá)到12h后，亞油酸純度和回收率均趨于平緩。因此，包合時(shí)間選擇12h左右較為適宜。

2.2 乙醇∶尿素對(duì)亞油酸純化效果的影響

圖2 乙醇:尿素對(duì)亞油酸純化效果的影響Fig.2 Effect of ethanol-urea ratio on purity of linoleic acid

由圖2可知，當(dāng)乙醇∶尿素小于3∶1(mL/g)時(shí)，亞油酸的純度隨著乙醇∶尿素比例的增大而升高，當(dāng)乙醇∶尿素大于3∶1(mL/g)時(shí)，亞油酸的純度隨著乙醇∶尿素比例的增大反而降低；當(dāng)乙醇∶尿素小于3∶1(mL/g)時(shí)，亞油酸的回收率隨著乙醇∶尿素比例的增大而增大，當(dāng)乙醇∶尿素為4∶1(mL/g)時(shí)，亞油酸回收率增幅趨于平緩。尿素用量越多，所得產(chǎn)品純度就越高，但產(chǎn)品的回收率越低[12]。綜合考慮亞油酸的純度和回收率，乙醇與尿素的比例選擇3∶1(mL/g)左右較為適宜。

2.3 包合溫度對(duì)亞油酸純化效果的影響

由圖3可知，隨著包合溫度的降低，亞油酸的純度升高而回收率下降[8]。當(dāng)包合溫度在-15～-5℃時(shí)，亞油酸的純度趨于平緩，但回收率趨于上升；當(dāng)包合溫度在-5～10℃時(shí)，亞油酸回收率上升，但其純度下降。綜合考慮亞油酸的純度和回收率，包合溫度選擇-5℃比較合適。

圖3 包合溫度對(duì)亞油酸純化效率的影響Fig.3 Effect of adduction temperature on purity of linoleic acid

2.4 尿素與原料比對(duì)亞油酸純化效果的影響

圖4 尿素:油脂對(duì)亞油酸純化效率的影響Fig.4 Effect of urea-oil ratio on purity of linoleic acid

由圖4可知，當(dāng)尿素與原料的比例在2∶1～6∶1(g/g)之間時(shí)，亞油酸純度和回收率變化均不大；繼續(xù)增大原料用量到1∶1(g/g)時(shí)，會(huì)有少量原料未被尿素絡(luò)合，使得亞油酸純度較低，但回收率較高。綜合考慮亞油酸的純度、回收率以及成本因素，選取尿素與原料的比例為2∶1(g/g)較合適。

2.5 尿素包合法純化火棘籽油中亞油酸提取工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)

由表2極差值R分析可知，影響亞油酸純度的主要因素主次順序?yàn)椋篋＞C＞B＞A；影響亞油酸回收率的主要因素主次順序?yàn)椋篋＞A＞B＞C。從k值大小可知，影響亞油酸純度最優(yōu)化工藝組合條件為：包合時(shí)間12h、乙醇∶尿素3∶1(mL/g)、包合溫度-10℃、尿素∶原料2∶1(g/g)，在此條件下進(jìn)行3次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，亞油酸純度為68.83%，回收率為63.42%；影響亞油酸回收率最優(yōu)化工藝組合條件為：包合時(shí)間10h、乙醇∶尿素3∶1(mL/g)、包合溫度-5℃、尿素∶原料1∶1(g/g)，在此條件下進(jìn)行3次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，亞油酸純度為58.76%，回收率為76.45%。綜合考慮亞油酸純度和回收率，得出尿素包合法純化火棘籽油中亞油酸的最佳工藝條件為包合時(shí)間12h、乙醇∶尿素3∶1(mL/g)、包合溫度-5℃和尿素∶原料2∶1(g/g)。

表2 尿素包合法純化火棘籽油中亞油酸正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Orthogonal array design and corresponding experimental results

2.5 GC-MS分析結(jié)果

2.5.1 原料脂肪酸組成及相對(duì)含量

圖5 火棘籽油GC-MS總離子流圖Fig.5 GC-MS total ion current chromatogram of Pyracantha fortuneana seed oil

表3 火棘籽油脂肪酸組成及相對(duì)含量Table 3 Fatty acid composition of fatty acids in Pyracantha fortuneana seed oil

由圖5和表3可知，火棘籽油的脂肪酸成分主要有：軟脂酸(11.09%)、亞油酸(38.40%)、油酸(20.69%)、硬脂酸(2.73%)、鯊烯(0.46%)，未檢出亞麻酸。其中，亞油酸的含量最高。

2.5.2 原料純化后的脂肪酸組成及相對(duì)含量

圖6 純化后的火棘籽油GC-MS總離子流圖Fig.6 GC-MS total ion current chromatogram of purified Pyracantha fortuneana seed oil

表4 純化后的火棘籽油脂肪酸組成及相對(duì)含量Table 4 Fatty acid composition of purified Pyracantha fortuneana seed oil

由圖6和表4可知，純化后的火棘籽油主要含有：軟脂酸(6.63%)、亞油酸(68.55%)、油酸(14.43%)、硬脂酸(0.78%)、鯊烯(2.43%)。與國(guó)內(nèi)同一類型研究比較[21-23]，為首次從火棘籽油中檢測(cè)到鯊烯。

2.5.3 鯊烯純度分析

圖7 純化后的鯊烯GC-MS總離子流圖Fig.7 GC-MS total ion current chromatogram of separated squalene

由圖7可知，譜圖中主出現(xiàn)一個(gè)主峰，經(jīng)計(jì)算其譜圖峰面積，得到此測(cè)定物的相對(duì)含量為98.16%，GCMS分析此物質(zhì)為鯊烯，相似度為97%。

3 結(jié) 論

3.1 火棘籽油在原料∶尿素∶乙醇＝1∶2∶6(g/g/mL)、-5℃條件下包合12h，亞油酸的純度從38.40%提高到68.55%，回收率為72.23%。為了提高產(chǎn)品純度，可采用多次尿素包合法。

3.2 從火棘籽油中分離得到鯊烯，采用柱層析純化的鯊烯純度達(dá)到98.16%。

3.3 在尿素包合法純化亞油酸過程中，由于有相當(dāng)一部分尿素溶于乙醇中，使得包合的飽和脂肪酸和單不飽和脂肪酸存在于液相中，使用石油醚、正己烷等溶劑萃取時(shí)形成一個(gè)均一體系，給分離純化多不飽和脂肪酸帶來極大的困難。因此，解決這一難點(diǎn)是尿素包合法分離純化得到高純度多不飽和脂肪酸的關(guān)鍵。

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Purification of Linoleic Acid and Squalene from Pyracantha fortuneana Seed Oil by Urea Adduction Fractionation

LIANG Xian-chang1，LI Jia-xing1，TIAN Xiang-rong2，HU Ping-ping3，HUANG Shou-en3，HUANG Cheng4,*
(1. Key Laboratory of Hunan Forest Product and Chemical Industry Engineering, Zhangjiajie 427000, China；2. College of Biology and Environmental Sciences, Jishou University, Jishou 416000, China；3. College of Food Science and Engineering, Central South University of Forest and Technology, Changsha 410004, China；4. College of Chemistry and Chemical Engineering, Jishou University, Jishou 416000, China)

In this work, urea adduction fractionation was used to purify linoleic acid from Pyracantha fortuneana seed oil and the purified product was further separated by silica column chromatography to obtain squalene. The effects of adduction time, adduction temperature and oil-urea-ethanol ratio on the purity and recovery rate of linoleic acid were probed by one-factor-ata-time and orthogonal array design methods. The analysis of linoleic acid and squalene was performed by GC-MS. The results showed the optimal adduction parameters were adduction time of 12 h, adduction temperature of -5 ℃, and oil-urea-alcohol ratio of 1∶2∶6 (g/g/mL). Under the optimal adduction conditions, the purity of linoleic acid was increased from 38.40% to 68.55%, and the recovery rate of linoleic acid reached up to 72.23%. After separation by silica column chromatography, a squalene sample with 98.16% purity was obtained .

Pyracantha fortuneana；urea adduction fractionation；linoleic acid；column chromatography；squalene；gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS)

TS225

A

1002-6630(2011)16-0127-05

2011-02-19

湖南省高?！傲之a(chǎn)資源化學(xué)與林化產(chǎn)品開發(fā)”科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)支持計(jì)劃項(xiàng)目(湘教通<2010>212號(hào))；吉首大學(xué)研究生科研創(chuàng)新項(xiàng)目 (JGY201015)

梁先長(zhǎng)(1986—)，男，碩士研究生，研究方向?yàn)榱痔禺a(chǎn)品的開發(fā)與產(chǎn)業(yè)化。E-mail：liangxianchang1@126.com

*通信作者：黃誠(chéng)(1963—)，男，教授，碩士，研究方向?yàn)槭称坊瘜W(xué)與營(yíng)養(yǎng)檢測(cè)。E-mail：jidahuangcheng@163.com