馬 龍，姚 晗，孫蘭萍，許 暉

(蚌埠學院生物與食品工程系，安徽 蚌埠 233000)

超聲波輔助提取杜仲翅果桃葉珊瑚甙工藝優(yōu)化

馬 龍，姚 晗，孫蘭萍，許 暉

(蚌埠學院生物與食品工程系，安徽 蚌埠 233000)

目的：研究超聲波輔助提取杜仲翅果中桃葉珊瑚甙的較佳工藝條件，為杜仲翅果資源的綜合開發(fā)利用提供參考。方法：在單因素試驗的基礎上，通過Box-Behnken試驗設計確定乙醇體積分數、超聲波功率、提取時間及液料比等因素的最佳工藝條件。結果：超聲波輔助提取杜仲翅果中桃葉珊瑚甙的最佳提取工藝條件為乙醇體積分數72.1%、超聲波功率300W，提取時間20.5min、液料比12.3∶1(mL/g)，在該條件下杜仲翅果桃葉珊瑚甙的實際提取率為5.91%。在試驗范圍內各因素對桃葉珊瑚甙得率影響大小依次為乙醇體積分數＞料液比＞提取時間。結論：超聲波輔助提取法能夠較好地提取杜仲翅果桃葉珊瑚甙。

杜仲翅果；桃葉珊瑚甙；超聲波輔助提??；響應曲面法

杜仲(Eucommia ulmoides Oilv.)多年生落葉喬木植物，杜仲科杜仲屬，被列為國家二級重點保護植物，是我國特有的名貴經濟樹種和貴重的中藥材[1]。桃葉珊瑚甙是一種環(huán)烯醚萜甙類化合物，具有護肝解毒[2]、抗炎[3]、抗氧化[4]、抗衰老[5]、抗骨質疏松[6]及抗腫瘤[7]等眾多藥理活性，在杜仲中含量豐富，分布于杜仲各部位，張康健等[8]對杜仲中藥用活性成分進行分析比較發(fā)現杜仲翅果是杜仲各部位中桃葉珊瑚甙含量最多的部位。

目前，桃葉珊瑚甙的傳統(tǒng)提取方法多采用加熱浸提法，但是桃葉珊瑚甙為C4去甲基環(huán)烯醚萜化合物，對熱敏感，易氧化分解，高溫和長時間加熱都不利于其提取[9]。為了減少桃葉珊瑚甙在提取過程中由于溫度造成的損失，一些學者嘗試使用了超聲波提取技術[10]、超臨界CO2萃取技術[11]、酶法提取技術[12]、微波提取技術[13-14]等先進的提取技術從杜仲不同部位提取桃葉珊瑚甙，均取得了較好的提取效果。超聲波輔助提取技術是一種新的提取分離技術，與傳統(tǒng)提取方法相比具有高效、省時、節(jié)能等優(yōu)點，現已廣泛應用于天然產物的提取。考慮到杜仲翅果果仁周圍緊密地包附有薄翅，難以分離，本實驗直接以杜仲翅果為原料進行提取[15]，采用超聲波輔助提取技術，利用響應曲面法對杜仲翅果中桃葉珊瑚甙的提取工藝進行研究，探討較佳工藝流程，為杜仲翅果的開發(fā)利用提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

杜仲翅果(帶殼粉碎，索氏抽提脫脂脫膠，60℃烘干，過40目篩備用) 陜西省略陽縣杜仲開發(fā)中心。

桃葉珊瑚甙標準品 中國藥品生物制品檢定所；Epstahl試劑(對二甲氨基苯甲醛0.25g，冰醋酸50g，35%磷酸5g，水20mL)、石油醚、甲醇、乙醇、鹽酸等均為分析純。

752紫外可見分光光度計 上海菁華科技儀器有限公司；JP300超聲波萃取器 武漢嘉鵬電子有限公司。

1.2 方法

1.2.1 工藝流程

杜仲翅果→粉碎→脫油脫膠→干燥→過篩→提取→過濾→提取液→測定含量

1.2.2 單因素試驗

分別以乙醇體積分數、超聲波功率、提取時間和液料比為因素進行單因素試驗，考察各因素對杜仲翅果中桃葉珊瑚甙得率的影響，確定各因素的變化范圍。

1.2.3 Box-Behnken試驗設計

綜合考慮單因素試驗結果，選用乙醇體積分數、提取時間、液料比為試驗因素，以杜仲翅果桃葉珊瑚甙得率為響應值，進行3因素3水平Box-Behnken試驗，優(yōu)化杜仲翅果桃葉珊瑚甙提取工藝參數。試驗設計因素水平及編碼見表1。

表1 Box-Behnken試驗設計因素水平及編碼Table 1 Factors and their levels in Box-Behnken experimental design

1.2.4 桃葉珊瑚甙含量的測定

1.2.4.1 桃葉珊瑚甙標準曲線的繪制[16]

精確稱取桃葉珊瑚甙標準品5.4mg，用甲醇溶解并定容至10mL容量瓶中，配成質量濃度0.54mg/mL的桃葉珊瑚苷甲醇標準溶液。分別吸取該溶液0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00mL于10mL比色管中，依次加入1.7mL Epstahl試劑、0.5mL 20%鹽酸、2.5mL 95%乙醇，加蒸餾水定容至刻度，在75℃水浴中顯色20min，冷卻10min后于波長596nm處測定其吸光度，以試劑空白作參比。桃葉珊瑚甙質量濃度(X，μg/mL)與吸光度(Y)的線性回歸方程：Y=0.0161X＋0.0332，R2=0.9954。

1.2.4.2 樣品中桃葉珊瑚甙含量的測定

準確吸取濃度適宜的樣品溶液1.00mL于10mL比色管中，依次加入1.7mL Epstahl試劑、0.5mL 20%鹽酸、2.5mL 95%乙醇，加蒸餾水定容至刻度，在75℃水浴中顯色20min，冷卻10min后，于波長596nm處測定其吸光度，以試劑空白作參比。對照桃葉珊瑚苷質量濃度測定的標準曲線，求得樣品溶液中桃葉珊瑚苷質量濃度。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果分析

2.1.1 提取劑體積分數對提取效果的影響

稱取經預處理的杜仲翅果粉1g，按液料比10∶1，分別加入體積分數0、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%乙醇水溶液，在超聲波功率300W條件下處理15min，測杜仲翅果中桃葉珊瑚甙得率。提取劑體積分數對得率的關系曲線如圖1所示。

圖1 提取劑體積分數對桃葉珊瑚甙得率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on extraction yield of aucubin

從圖1可以看出，當乙醇體積分數在0～70%范圍內時，桃葉珊瑚甙的得率隨乙醇體積分數的增加而升高，并在70%時達到最大值；乙醇體積分數超過70%時，得率開始大幅下降，而且提取液開始變渾濁，說明有較多醇溶性物質溶出，提取效果降低。因此選擇較佳的乙醇水溶液體積分數為70%。

2.1.2 超聲波功率對提取效果的影響

稱取經預處理的杜仲翅果粉1g，按液料比10∶1，加入體積分數70%乙醇水溶液，分別在超聲波功率60、120、180、240、300W條件下處理15min，測定杜仲翅果中桃葉珊瑚甙得率。超聲波功率對得率的關系曲線如圖2所示。

圖2 超聲波功率對桃葉珊瑚甙得率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic power on extraction yield of aucubin

從圖2可以看出，桃葉珊瑚甙得率隨著超聲波功率的增加而增加。這是因為超聲波功率越大，所產生的空穴作用和機械攪拌作用越強烈，分子擴散速度也越大，桃葉珊瑚甙滲出就越快。由于本實驗所使用的超聲波萃取器的最大功率為300W，根據曲線趨勢桃葉珊瑚甙的得率還可能繼續(xù)增大，超聲波功率300W并不一定是最佳條件，故超聲波功率因素不帶入Box-Behnken試驗。

2.1.3 提取時間對提取效果的影響

稱取經預處理的杜仲翅果粉1g，按液料比10∶1，加入體積分數70%乙醇水溶液，在超聲波功率300W條件下分別處理10、20、30、40、50、60min，測定杜仲翅果中桃葉珊瑚甙得率。提取時間對得率的關系曲線如圖3所示。

圖3 提取時間對得率的影響Fig.3 Effect of extraction time on extraction yield of aucubin

從圖3可以看出，超聲波處理20min的桃葉珊瑚甙得率明顯高于處理10min的得率，這可能是由于超聲波對杜仲翅果組織結構的破壞作用不斷加大，溶出物多，得率也高；但是超聲波處理超過20min后，桃葉珊瑚甙得率不但不再增加，反而顯著下降，主要原因可能是隨著提取時間的延長，溶液體系的溶質濃度逐漸達到了平衡，同時持續(xù)的超聲波作用使溶出的部分桃葉珊瑚甙的分子結構遭到破壞。因此選取較佳的提取時間為20min。

2.1.4 液料比對提取效果的影響

稱取經預處理的杜仲翅果粉1g，分別按液料比5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1，加入體積分數70%乙醇水溶液，在超聲波功率300W的條件下處理20min，測定杜仲翅果中桃葉珊瑚甙得率。液料比對得率的關系曲線如圖4所示。

圖4 液料比對桃葉珊瑚甙得率的影響Fig.4 Effect of solid/liquid ratio on extraction yield of aucubin

從圖4可知，隨著溶劑用量的增加，桃葉珊瑚甙得率逐漸升高。當液料比在5∶1～15∶1范圍內時，桃葉珊瑚甙得率上升較快；但當液料比超過15∶1時，得率增長趨勢比較平緩，基本持平。這可能是因為超聲波輔助提取實質上也是溶質萃取過程，根據擴散定律可知，隨著溶劑用量的增加，杜仲翅果粉與溶劑接觸面的濃度差增大，從而提高了溶質與溶劑的擴散速度，提取率增大；隨著杜仲翅果粉中桃葉珊瑚甙的不斷溶出，導致濃度差下降，擴散速度減小，逐漸達到平衡狀態(tài)。由于杜仲翅果中桃葉珊瑚甙的含量是一定的，當溶劑用量過大時，會造成溶劑浪費，增加后續(xù)濃縮工序的負荷，基于降低生產成本考慮，因此選擇較佳的液料比為15∶1 (mL/g)。

2.2 Box-Behnken試驗設計結果與分析

2.2.1 回歸模型的擬合與檢驗

Box-Behnken試驗設計方案及結果、方差分析和參數估計及顯著性分析分別見表2～4，試驗按隨機順序進行。

運用Minitab15統(tǒng)計分析軟件對表2中的試驗結果進行多元回歸擬合，獲得桃葉珊瑚甙得率對乙醇體積分數、提取時間、液料比的二次多項回歸模型方程：

Y=5.85＋0.25Xl＋0.10X2＋0.18X3-0.42Xl2-0.26X22-0.15X32-0.06XlX2-0.09XlX3＋0.01X2X3

表3表明，二次回歸模型的F值=106.53＞F0.01(9,5)= 10.15及F0.05(9,5)= 4.77，相應的P＜0.0001，該方差的模型達到極其顯著；而失擬項的F值=2.61＜F0.05(3,2)=19.16，其相應的P=0.289，表明失擬性差異不顯著，該回歸方差無失擬因素存在，符合模型要求。回歸診斷結果說明該二次回歸模型擬合效果很好，其決定系數r2=1.75/1.77=0.9887，具有高度的相關性，表明模型的實測值與預測值之間具有較好的擬合優(yōu)度，故模型成立。

表2 Box-Behnken試驗設計方案及響應值的實測值和預測值Table 2 Box-Behnken experimental design and corresponding predicted and experimental values of extraction yield of aucubin

表3 回歸模型方差分析表Table 3 Analysis of variance of the predictive model for extraction yield of aucubin

表4 回歸方程參數估計及顯著性分析Table 4 Coefficient estimate and significance of each term of the predictive model for extraction yield of aucubin

為利用二次多項式回歸模型方程獲得優(yōu)化值，根據表4中回歸方程參數顯著性分析結果剔除未達到0.25以上顯著水平的因素，得到修正后的回歸方程為：

Y = 5.85 + 0.25Xl＋0.10X2＋0.18X3-0.42X12-0.26X22-0.15X32-0.06XlX2-0.09X1X3

修正后的二次回歸模型的F值提高至137.77，失擬項的F值下降至2.06，決定系數r2提高至0.9946，故新的回歸方程擬合效果進一步提高。

2.2.2 主效應分析

從表3和表4可以看出，一次項、二次項和交互項的X1X3對響應值有顯著或極顯著影響，即乙醇體積分數、提取時間、液料比和乙醇體積分數與液料比的交互作用對得率產生顯著的影響。

回歸方程參數顯著性分析的t值可以反映出各因素對試驗指標的重要性，∣t∣值越大，表明對試驗指標的影響越大，即重要性越大。從表4可知，各試驗因素的影響程度從大到小排列依次為：乙醇體積分數＞料液比＞提取時間。

2.2.3 響應面分析

圖5 乙醇體積分數和提取時間對桃葉珊瑚甙得率的曲面圖及等高線圖Fig.5 Response surface and contour plots showing the effects of ethanol concentration and extraction time on extraction yield of aucubin

多元回歸方程的響應曲面圖及及等高線圖見圖5～7。通過對該組動態(tài)圖的分析即可對各因素及任意兩因素之間的交互作用影響得率的效應進行評價。等高線圖的形狀可以反映出兩因素間交互作用的強弱大小，橢圓形表示二者交互作用顯著，而圓形則表示二者交互作用不顯著。從圖5和圖7中可以直觀地看出乙醇體積分數和提取時間、提取時間和液料比對杜仲翅果中桃葉珊瑚甙得率的交互作用不顯著，與統(tǒng)計分析結果相符。從圖6中可以看出乙醇體積分數和液料比對杜仲翅果中桃葉珊瑚甙得率的交互作用顯著。

圖6 乙醇體積分數和液料比對桃葉珊瑚甙得率的曲面圖及等高線圖Fig.6 Response surface and contour plots showing the effects of ethanol concentration and solid/liquid ratio on extraction yield of aucubin

圖7 提取時間和液料比對桃葉珊瑚甙得率的曲面圖及等高線圖Fig.7 Response surface and contour plots showing the effects of extraction time and solid/liquid ratio on extraction yield of aucubin

2.2.4 二次多項式數學模型尋優(yōu)與驗證

對修正后的二次多項式數學模型方程解逆矩陣，得到杜仲翅果桃葉珊瑚甙的超聲波輔助提取的較優(yōu)最佳工藝參數為乙醇體積分數72.1%、提取時間20.5min、液料比12.3∶1(mL/g)，在該工藝條件下得率的預測值為5.94%。

為了驗證所得結論的正確性，選擇響應曲面法優(yōu)化所得到的工藝參數進行進行杜仲翅果桃葉珊瑚甙得率的對照試驗，得率的實際值為5.91%，二者相對誤差僅0.5%，說明試驗優(yōu)化得到的工藝參數基本是可靠的。

3 結 論

利用響應曲面法優(yōu)化得到超聲波輔助提取杜仲翅果桃葉珊瑚甙的較佳工藝參數為：乙醇體積分數72.1%、超聲波功率300W、提取時間20.5min、液料比12.3∶1(mL/g)，在該條件下，杜仲翅果桃葉珊瑚甙的提取率為5.91%。超聲波輔助法提取杜仲翅果桃葉珊瑚甙具有收率高、節(jié)省溶劑、生產周期短、有效成分不易被破壞等優(yōu)點，應用前景十分廣闊。

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Process Optimization for Ultrasonic-assisted Extraction of Aucubin from Eucommia ulmoides Oliv. Key Fruits

MA Long，YAO Han，SUN Lan-ping，XU Hui
(Department of Biotechnology and Food Engineering, Bengbu College, Bengbu 233000, China)

Objective∶ To optimize the conditions for ultrasonic-assisted extraction of aucubin from Eucommia ulmoides Oliv. key fruits. Methods∶ One-factor-at-a-time method and response surface methodology based on Box-Behnken experimental design were used for process conditions optimization. Results∶ The optimal extraction conditions were 72.1% aqueous ethanol solution as the extraction solvent, ultrasonic power of 300 W, extraction time of 20.5 min and solid/liquid ratio of 12.3∶1 (mL/g). Under these conditions, the extraction yield of aucubin was observed to be 5.91%. Ethanol concentration had the largest impact on the extraction yield of aucubin, followed by solid/liquid ratio and extraction time. Conclusion∶ Ultrasonic assistance can enhance the extraction of aucubin from Eucommia ulmoides Oliv. key fruits.

Eucommia ulmoides Oliv. key fruits；aucubin；ultrasonic wave-assisted extraction；response surface methodology

R284.2

A

1002-6630(2011)16-0080-05

2010-10-26

安徽省高等學校自然科學研究重點項目(KJ2011Z240)；安徽省高等學校省級食品科學與工程特色專業(yè)建設點資助項目(20101091)；安徽省食品科學與工程教學團隊項目(20101094)

馬龍(1979—)，男，講師，碩士，研究方向為農產品加工與貯藏工程。E-mail：malongbb@163.com