劉 柳，李南薇，郭 勇

(1.暨南大學(xué)食品科學(xué)與工程系，廣東 廣州 510632；2.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院輕工食品學(xué)院，廣東 廣州 510225；3.華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510641)

親和層析法分離純化納豆激酶

劉 柳1，李南薇2，郭 勇3

(1.暨南大學(xué)食品科學(xué)與工程系，廣東 廣州 510632；2.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院輕工食品學(xué)院，廣東 廣州 510225；3.華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510641)

目的：以納豆激酶的作用底物纖維蛋白為配基制備親和層析膠，分離純化納豆激酶。方法：納豆桿菌發(fā)酵液經(jīng)硫酸銨分段鹽析、透析得粗酶，在4℃條件親和層析法分離純化，利用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)對(duì)酶純度進(jìn)行檢驗(yàn)。結(jié)果：經(jīng)親和層析得納豆激酶為電泳純，純化倍數(shù)為8.3，回收率43.9%。純酶的最適pH值和溫度分別為pH7.0～9.0、50℃；溫度高于60℃纖溶酶活性迅速下降；在pH6.0～10.0范圍內(nèi)穩(wěn)定性好；Mg2＋對(duì)其有微弱激活作用，Cu2+有顯著抑制作用。結(jié)論：以瓊脂糖包埋纖維蛋白制備的層析膠可用于納豆激酶的快速分離純化。

納豆激酶；分離純化；親和層析；纖維蛋白；酶學(xué)性質(zhì)

1987年，日本學(xué)者須建洋行首次發(fā)現(xiàn)日本傳統(tǒng)的大豆發(fā)酵食品納豆中含有溶解血纖維蛋白的成分，并將其命名為納豆激酶(nattokinase，NK)[1]。與傳統(tǒng)的溶栓劑相比，NK具有不易引起出血、無(wú)抗原性、半衰期長(zhǎng)、安全無(wú)毒且成本低廉和能口服吸收溶栓等優(yōu)點(diǎn)，因而具有廣闊的開(kāi)發(fā)前景，可能成為新一代的溶栓藥物[2]。目前，國(guó)內(nèi)對(duì)該酶的提取途徑主要是選高產(chǎn)酶的納豆菌株發(fā)酵，再通過(guò)等電點(diǎn)法、鹽析法、層析法等方法提取發(fā)酵液中的納豆激酶[3]。本實(shí)驗(yàn)擬利用高產(chǎn)酶的納豆桿菌發(fā)酵，發(fā)酵液經(jīng)硫酸銨分段鹽析、透析得納豆激酶粗酶液，粗酶液過(guò)親和層析柱分離出納豆激酶純酶；對(duì)純酶最適溫度與pH值、穩(wěn)定性等酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和利用該酶提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

納豆枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis subsp natto)由實(shí)驗(yàn)室保存；纖維蛋白原、人凝血酶、尿激酶(純度＞99%)中國(guó)藥品生物制品檢定所；瓊脂糖 北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司；苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF) 南京賽吉科技有限公司；胃酶抑素A(Pepstain A)、亮抑酶肽(Leupeptin) 美國(guó)Amresco公司；抑肽酶(Aprotinin) 美國(guó)Sigma-Aldrich公司；其他生化試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

蛋白電泳分析儀 美國(guó)Bio-Rad 公司；UV-1800紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京瑞利分析儀器公司；FD-1冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器公司；DUPONT-RC5C低溫高速離心機(jī) 美國(guó)GT Soral公司。

1.3 親和層析介質(zhì)的制備

將一定量人血纖維蛋白原以50mg/mL溶于無(wú)菌水中，37℃恒溫直至完全溶解；將瓊脂糖溶于40mmol/L pH7.8巴比妥鈉-HCl緩沖液中配制成15mg/mL的溶液，滅菌后冷卻至50℃；加入已經(jīng)溶解的纖維蛋白原和適量的人凝血酶，恒溫30min；用注射器滴入預(yù)冷至4℃的四氯乙烯中，制成球形顆粒。去離子水清洗包埋顆粒后于37℃恒溫2h后再做交聯(lián)，交聯(lián)劑為40mg/mL的戊二醛水溶液。去離子水清洗后于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 納豆激酶的分離純化

1.4.1 納豆激酶的粗提取

在100mL三角燒瓶中分裝20mL LB培養(yǎng)基，接種一環(huán)斜面保藏的納豆枯草芽孢桿菌，150r/min、35℃，搖床振蕩培養(yǎng)20h。6mL培養(yǎng)液加至裝有200mL發(fā)酵培養(yǎng)基(含可溶性淀粉10mg/mL、大豆蛋白胨10mg/mL、磷酸氫二鉀4mg/mL、磷酸二氫鈉4mg/mL、硫酸鎂0.75mg/mL、氯化鈣0.2mg/mL；pH7.0～7.2)的500mL三角燒瓶中，150r/min，35℃搖床振蕩培養(yǎng)72h。發(fā)酵結(jié)束后，8000r/min離心20min，收集上清液。

上清液加硫酸銨至飽和度30%，4℃靜置5h，12000r/min離心20min取上清；繼續(xù)加硫酸銨至飽和度為65%，4℃靜置過(guò)夜，12000r/min離心20min取沉淀用10mL 0.04mol/L pH8.0巴比妥鈉-HCl緩沖液溶解、透析后得粗酶液備用。

1.4.2 親和層析

將制備好的層析膠裝于層析玻璃柱(φ1 0 m m× 200mm)中；先用10mL上樣緩沖液(0.04mol/L pH7.8巴比妥納-HCl)平衡柱，手動(dòng)上樣一定體積V0粗酶液，測(cè)其酶活為E0；再用一定量上樣緩沖液平衡柱，直至洗出液中檢測(cè)不出酶活為止，收集洗出液，測(cè)量體積V1、酶活E1；最后洗脫緩沖液(0.04mol/L pH5.6巴比妥納-HCl)洗脫，直至洗出液中檢測(cè)不出酶活為止，收集洗脫液，測(cè)量體積V2、酶活E2。

1.5 溶栓酶活力的測(cè)定

采用纖維蛋白平板法。參照并改良Astrup法[4]制備雙層纖維蛋白平板，依照楊明俊[5]、Painter[6]、韓秋霞[7]等報(bào)道的纖維蛋白平板法稍加改良，制作瓊脂-瓊脂糖雙層平板。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=0.9335χ-9.3208 (y為納豆激酶活力/U，χ為溶圈垂直直徑乘積/(mm2)，R2=0.9934。

1.6 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

參照Bradfor法[8]。以牛血清白蛋白為對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y＝117.03χ(R2=0.9959)，式中，y為蛋白質(zhì)濃度/(mol/mL)，χ為吸光度。

1.7 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE)凝膠電泳

采用不連續(xù)的凝膠系統(tǒng)，聚丙烯酰胺質(zhì)量分?jǐn)?shù)分離膠12%、濃縮膠5%，恒定電流于每塊電泳板8mA，考馬斯亮藍(lán)染色。

1.8 納豆激酶的酶學(xué)性質(zhì)

1.8.1 最適溫度、pH值

在不同溫度檢測(cè)纖溶酶活力；選擇不同pH值的緩沖液溶解酶粉，用相應(yīng)pH值的緩沖液配制纖維蛋白平板，以最高酶活為100%，計(jì)算相對(duì)酶活。

1.8.2 抑制劑、金屬離子對(duì)酶活的影響

1.0 mmol/L PMSF(溶劑為異丙醇)，0.25mmol/L PepstainA(溶劑為甲醇)，0.25mmol/L Leupep tin，10mmol/L EDTA。各抑制劑與酶液以體積比1∶1混合，振勻，測(cè)定酶活。配制CaCl2、CoCl2、CuSO4、MgCl2、MnSO4、FeCl2和ZnCl2溶液，與酶液適當(dāng)比例混合，使各金屬離子終濃度分別為5.0mmol/L，測(cè)定酶活，以稀釋相應(yīng)倍數(shù)酶為對(duì)照，計(jì)算相對(duì)酶活。

1.8.3 纖溶酶的穩(wěn)定性

溫度穩(wěn)定性：酶液置于不同溫度(4、25、37、45、50、60、65、70℃)恒溫1h，緩慢降溫至37℃測(cè)定活力，記錄37℃條件4h內(nèi)酶活變化情況。pH值穩(wěn)定性：配制不同pH值(pH3.5～13)的緩沖液與酶液1∶1混合， 37℃恒溫40min，以稀釋兩倍的酶液作為對(duì)照，記錄相對(duì)酶活。

2 結(jié)果與分析

2.1 納豆激酶的分離純化

親和層析柱上樣0.6mL粗酶液，平衡后用pH5.6的洗脫液洗脫，過(guò)柱時(shí)間為4h，得分離純化的結(jié)果如表1所示，吸附率52.9%，洗脫率96.7%，本步驟回收率51.2%。

與發(fā)酵上清液相比較，納豆激酶純化倍數(shù)達(dá)到8.3，總回收率為43.9%(表2)。親和層析后酶液經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)為一條帶(圖1)，經(jīng)計(jì)算納豆激酶亞基的分子質(zhì)量約為27.2kD。這與筆者用陰陽(yáng)離子交換和疏水柱層析法得到的結(jié)果一致[9]，但是純化步驟減少了兩步，比王萍等[10]的研究總回收率提高了30%。但是本方法分離納豆激酶每次處理的樣品量很少，僅為500U左右，馬躍華等[11]研究證明大豆顆粒對(duì)納豆激酶的親和吸附特性，未來(lái)將嘗試將大豆顆粒與纖維蛋白聯(lián)合制作親和膠以提高分離純化能力。

表1 納豆激酶親和層析結(jié)果Table 1 Purification of nattokinase by affinity chromatography

表2 納豆激酶分離純化結(jié)果Table 2 Separation and purification results of nattokinase

圖1 納豆激酶SDS-PAGE電泳圖譜Fig.1 SDS-PAGE of nattokinase

2.2 納豆激酶的酶學(xué)性質(zhì)

2.2.1 最適溫度

圖2 溫度對(duì)納豆激酶相對(duì)酶活力的影響Fig.2 Effect of temperature on nattokinase activity

納豆激酶在50℃時(shí)的相對(duì)酶活力最高；45～55℃，相對(duì)酶活均在95%以上，為最適反應(yīng)溫度范圍；隨溫度升高相對(duì)酶活力下降，溫度60℃以上時(shí)相對(duì)酶活在20%以下。

2.2.2 最適pH值

圖3 pH值對(duì)納豆激酶相對(duì)酶活力的影響Fig.3 Effect of pH on nattokinase activity

納豆激酶最適pH值范圍為pH7.0～9.0， pH值的降低對(duì)酶活的影響明顯，pH值為11.0時(shí)，納豆激酶相對(duì)酶活仍有80%。

2.2.3 抑制劑對(duì)酶活的影響

圖4 抑制劑對(duì)納豆激酶相對(duì)酶活力的影響Fig.4 Effect of inhibitors on nattokinase activity

亮抑酶肽(Leupeptin)與胃酶抑素(Pepstain)只能部分抑制纖溶酶活性。苯甲基磺酰氟(PMSF在濃度為0.5mmol/L時(shí)即可完全抑制纖溶酶活性，EDTA對(duì)酶活性基本沒(méi)有影響。PMSF為絲氨酸蛋白酶抑制劑，可推斷納豆激酶屬于絲氨酸蛋白酶，屬于金屬蛋白酶的可能性非常小。

2.2.4 金屬離子對(duì)酶活的影響

圖5 金屬離子對(duì)納豆激酶相對(duì)酶活力的影響Fig.5 Effect of metal ions on nattokinase activity

Mg2+有微弱的激活作用，Cu2+對(duì)納豆激酶的抑制作用最明顯，Ca2+無(wú)明顯作用；其他金屬離子對(duì)酶活有不同程度的抑制作用。這與前人的研究結(jié)果不盡相同[12-16]。

2.2.5 纖溶酶的穩(wěn)定性

2.2.5.1 熱穩(wěn)定性

圖6 溫度對(duì)納豆激酶穩(wěn)定性的影響Fig.6 Effect of temperature on stability of nattokinase

納豆激酶在溫度低于60℃恒溫1h后，相對(duì)酶活仍有80%以上，溫度高于60℃，酶活力迅速喪失(圖6)。而圖2顯示溫度高于55℃時(shí)，酶活急劇下降，可見(jiàn)60℃恒溫1h變性后的納豆激酶，在緩慢降溫至37℃后蛋白酶部分復(fù)性。

圖7 37℃納豆激酶酶活變化情況Fig.7 Effect of temperature on nattokinase stability

由圖7可知，37℃納豆激酶在4h內(nèi)相對(duì)酶活力都保持在75%以上，作為食源性藥品可以在人體內(nèi)存在較長(zhǎng)時(shí)間，更好地發(fā)揮藥效。

2.2.5.2 pH值穩(wěn)定性

圖8 pH值對(duì)納豆激酶穩(wěn)定性的影響Fig.8 Effect of pH on nattokinase stability

由圖8可知，納豆激酶在pH6～11范圍內(nèi)穩(wěn)定性好，相對(duì)酶活在80%以上。pH5.6、37℃保溫40min，相對(duì)酶活為65.3%。

3 結(jié) 論

納豆激酶在4℃、pH7.8條件下與纖維蛋白結(jié)合但是不發(fā)生反應(yīng)，在pH5.6時(shí)與纖維蛋白分離。故以瓊脂糖為載體、纖維蛋白為配基制成層析膠，分離出納豆激酶經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)為一條帶。與發(fā)酵上清液進(jìn)行比較，納豆激酶純化倍數(shù)達(dá)到8.3，總回收率為43.9%。親和層析介質(zhì)可以反復(fù)使用，從而降低了分離成本、節(jié)約了時(shí)間和人力。對(duì)納豆激酶酶學(xué)性質(zhì)研究發(fā)現(xiàn)，最適pH值和溫度分別為pH7.0～9.0、50℃；37℃恒溫4h酶活力仍在80%以上，pH6～11范圍內(nèi)穩(wěn)定性好。Mg2+對(duì)納豆激酶有微弱激活作用，Cu2+有顯著抑制作用。

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Affinity Chromatographic Purification of Nattokinase

LIU Liu1，LI Nan-wei2，GUO Yong3
(1. Department of Food Science and Engineering, Jinan University, Guangzhou 510632, China；2. College of Light Industry and Food Technology, Zhongkai University of Agricultural and Engineering, Guangzhou 510225, China；3. School of Bioscience and Bioengineering, South China University of Technology, Guangzhou 510641, China)

Objective∶ To separate and purify nattokinase by fibrin affinity chromatography. Methods∶ The fermentation supernatant of Bacillus subtilis subsp. natto was fractionally salted out with ammonium sulfate and dialyzed, and the crude nattokinase obtained was purified by affinity chromatographic column chromatography at 4 ℃. The purity of purified nattokinase was analyzed by SDS-PAGE. Results∶ Nattokinase of electrophoretical purity was obtained, with a purify fold of 8.3 and a recovery of 43.9%. The optimum reaction pH and temperature pf purified nattokinase were 7.0-9.0 and 50 ℃, respectively. The enzyme activity exhibited a sharp drop at temperatures above 60 ℃ and good stability in the pH range of 6.0-10.0. The enzyme was slightly activated by Mg2+but dramatically inhibited by Cu2+. Conclusion∶ Affinity chromatography on fibrinagarose is applicable to fast purify nattokinase.

nattokinase；purification；affinity chromatography；fibrin；characterization

TS201.2

A

1002-6630(2011)16-0058-04

2010-11-19

劉柳(1981—)，女，助理實(shí)驗(yàn)師，碩士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：cdliuliu@126.com