黃 敏，歐東梅，徐金環(huán)，張曉梅，張義成

(1、華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院檢驗科，湖北 武漢 430030；2、廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣東 廣州；3、華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院血液科)

獨立生長因子Gfi1是一種鋅指阻遏子，其位點是最常見的逆轉(zhuǎn)錄病毒插入位點之一[1]，在與Pim-1或Myc的共同作用下可顯著加速T細胞淋巴瘤的發(fā)展[2]，我們采用SYBR GreenⅠ染料法通過建立實時熒光定量PCR的標準品質(zhì)粒繪制標準曲線用于檢測Gfi1mRNA的表達，實現(xiàn)樣品拷貝數(shù)的準確定量。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 大腸桿菌E.coli DH5ɑ由本室保存；含有目的基因Gfi1cDNA的真核表達質(zhì)粒plox-Gfi1由本室構(gòu)建，Gfi1cDNA兩端帶有BamHⅠ酶切位點。

1.2試劑 限制性內(nèi)切酶BamHⅠ為大連寶生物公司；胰蛋白胨和酵母提取物為英國Oxoid公司；Taq酶為 Fermentas公司；SYBR Green I for real-time PCR液為日本TOYOBA公司；質(zhì)粒小量提取純化試劑盒為北京博大泰克生物基因技術(shù)有限責任公司。

1.3 儀器 ABI公司stepone熒光定量PCR儀；美國Biometra公司4800型PCR擴增儀；美國Beckman公司DU70型紫外分光光度儀；Alpha Innotech凝膠電泳分析系統(tǒng)。

1.4 目的片斷引物的設(shè)計、合成 應(yīng)用軟件oligo6.0，根據(jù)GenBank收錄的Gfi1mRNA全序列NM005263進行設(shè)計，引物跨越內(nèi)含子，避免基因組污染影響結(jié)果，目的片斷Gfi1長度為176bp，引物由上海博道生物技術(shù)公司合成。引物序列：上游引物：5＇-AGACCCTTTGCCTGCGAGATGTGC-3＇，下游引物：5＇-TAGGGCCGAGTGTCTGAGTGGATA-3＇。用無菌雙蒸水將引物配制成100pmol/μl的儲存液-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 目的基因Gfi1cDNA質(zhì)粒plox-Gfi1的鑒定 質(zhì)粒plox-Gfi1經(jīng)BamHⅠ酶切和PCR擴增及測序鑒定。 酶切反應(yīng)體系①10×緩沖液：2μl； ②plox-Gfi1：5μl；③BamHⅠ酶：1μl；④加滅菌蒸餾水至 20μl。酶切反應(yīng)條件：37℃酶切2h。PCR鑒定上下游引物分別 是 5＇-CTGGATCCCCATGCCGCGCTCATTTCTCG TCA AAAG-3＇；5＇-GCGGATCCTCATTTGAGCCCAT GC TGCGTCTCCCGGTG-3＇。 PCR 體系為：①5×Taq緩沖液：5μl； ②MgCl2：3μl ； ③dNTP(10mmol/L)：0.5μl；④plox-Gfi1 質(zhì)粒 DNA 模板 ：1μl；⑤上游引物(10pmol/μl)：1μl；⑥下游引物(10pmol/μl)：1μl；⑦Taq酶 ：1.5μl；⑧加滅菌蒸餾水至 50μl。 PCR 反應(yīng)條件：預(yù)變性 95℃ 5min，變性 94℃ 30s，退火 55℃1min，延伸72℃ 2min，共35個循環(huán)，循環(huán)后 72℃延伸10min。將酶切和PCR鑒定正確的的克隆送上海博道生物技術(shù)有限公司進行序列分析。

1.6 標準品質(zhì)粒拷貝數(shù)的換算 小量抽提純化質(zhì)粒plox-Gfi1，按1:100的稀釋度在紫外分光光度計中測定260nm和280nm的OD值，得出質(zhì)粒濃度為0.845μg/μl，根據(jù)公式[質(zhì)粒濃度(g/μl)/(660×質(zhì)粒長度 bp)]×6.022×1023(copies/μl)換算為 6.36×109copies/μl。

1.7 標準曲線和熔解曲線的建立 以6.36×109copies/μl的質(zhì)粒為母液，連續(xù)10倍梯度稀釋成6.36×102～6.36×108copies/μl的梯度濃度標準品， 采用SYBR Green I熒光定量PCR法對以上七個稀釋梯度的標準品質(zhì)粒模板進行擴增。定量PCR反應(yīng)體系包括： ①2×SYBR GreenⅠ液：5μl； ②上游引物(10pmol/ul)：0.2μl；③下游引物(10pmol/μl)：0.2μl；④標準品質(zhì)粒DNA模板：1μl； ⑤加滅菌蒸餾水至10μl。擴增條件為： 95℃預(yù)變性 1 min，95℃變性15s，60℃退火 15s，72℃延伸 45s，共 40 個循環(huán)，在每個循環(huán)的延伸末檢測熒光信號。隨著PCR儀在每個循環(huán)結(jié)束后測定的吸光值就得到了以標準品濃度的對數(shù)值為橫坐標，Ct值為縱坐標的標準曲線。反應(yīng)結(jié)束后進行熔解曲線分析，95℃ 15s，60℃ 1min，95℃ 15s，每隔0.3℃測定吸光值。這樣就得到了PCR產(chǎn)物的熔解曲線，以了解反應(yīng)的特異性，保障測定的結(jié)果的準確可靠。

1.8 電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物 為了驗證SYBR GreenⅠ染料方法的特異性，我們將擴增產(chǎn)物在25g/L瓊脂糖凝膠中進行電泳。一旦PCR產(chǎn)物的長度正確并未見雜帶，則僅用實時定量PCR熔解曲線中的熔解溫度(Tm)監(jiān)測反應(yīng)特異性即可。

1.9 標準品穩(wěn)定性與重復(fù)性 將每個梯度的標準品平行操作5次和在5d內(nèi)分別測定，計算Ct平均值、標準差，獲取其批內(nèi)變異系數(shù)和批間變異系數(shù)，比較同一濃度、同一次反應(yīng)不同反應(yīng)管間的批內(nèi)變異及不同時間反應(yīng)結(jié)果的批間變異。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)粒plox-Gfi1鑒定

重組質(zhì)粒plox-Gfi1經(jīng)BamHⅠ單酶切及PCR擴增后均獲得了符合預(yù)期大小的條帶(約1200bp)。將含重組質(zhì)粒的陽性克隆送上海博亞公司自動測序儀進行測定,結(jié)果經(jīng)blast進行分析，顯示插入片斷序列與基因庫收錄的Gfi1 (收錄號NM005263)一致。

2.2 Gfi1質(zhì)粒標準曲線的建立

圖1 實時熒光定量PCR擴增曲線

當質(zhì)粒 DNA 濃度在 6.36×102～6.36×108copies/μl范圍時，曲線為一組典型的倒S型曲線(圖1)，模板濃度越高，循環(huán)閾值越小，各梯度起始模板拷貝濃度與循環(huán)閾值之間呈良好的線性關(guān)系。隨循環(huán)數(shù)的增加，熒光信號逐漸增強，而當循環(huán)數(shù)達到一定程度時，熒光強度達到平臺。以標準品稀釋滴度的對數(shù)值為橫坐標，以循環(huán)閾值為縱坐標建立實時定量PCR的標準曲線 (圖2)，其線性回歸方程為y=-3.441x+40.314，y為Ct值，x為待測樣品濃度的對數(shù)值，標準曲線斜率為-3.441，γ2=0.996。

圖2 實時熒光定量PCR標準曲線

2.3 實時熒光擴增熔解曲線

圖3 標準品質(zhì)粒plox-Gfi1熔解曲線

根據(jù)所得的熔解曲線(圖3)，在90℃左右出現(xiàn)單一的熔解峰，曲線平穩(wěn)，峰尖且窄，提示各濃度質(zhì)粒熔解溫度均一，擴增產(chǎn)物特異性好，以此為基礎(chǔ)進行定量是可靠的。

2.4 方法的特異性與靈敏度

將PCR產(chǎn)物用25g/L瓊脂糖凝膠電泳在176 bp處獲得一條帶，未發(fā)現(xiàn)明顯的雜帶，熒光定量PCR反應(yīng)線性范圍廣，可達7個log值的范圍(6.36×102～6.36×108)，敏感性高，起始拷貝數(shù)在 6.36×102就可獲得良好的定量效果。為對樣品進行準確定量奠定了良好的基礎(chǔ)。而采用常規(guī)PCR檢測標準品的起始拷貝數(shù)為 6.36×104copies/μl(圖 4)。

圖4 標準品質(zhì)粒plox-Gfi1常規(guī)PCR擴增電泳結(jié)果

2.5 穩(wěn)定性與重復(fù)性

將 7 個不同稀釋度(6.36×108～6.36×102copies/ml)的標準品同批次各重復(fù)5管檢測，得其批內(nèi)CV%為1.35%～3.61%。將上述7個標準品分5批次在不同時間進行檢測，得其批間CV%為1.49%～3.42%(表1)。表明標準品及該實驗體系具有較好的穩(wěn)定性和重復(fù)性。

表1 標準品質(zhì)粒plox-Gfi1穩(wěn)定性與重復(fù)性評價

3 討論

Gfi1在人類基因組定位于染色體1p22，其羧基端含有6個C2H2的鋅指DNA結(jié)構(gòu)域，氨基端含有由20-氨基酸組成的SNAG結(jié)構(gòu)域，SNAG是高度保守的，主要發(fā)揮核定位和轉(zhuǎn)錄阻遏作用[3]。Gfi1可以使T細胞系不依耐IL-2就能生存從而在小鼠T細胞淋巴瘤形成中發(fā)揮重要作用[4]。近來有研究表明MDS伴外周血低白細胞的患者Gfi1基因在mRNA水平的表達是降低的[5]，但是Gfi1mRNA在其它惡性血液病中絕對表達量的情況國內(nèi)尚無報道。

實時熒光定量PCR是一種在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。本實驗采用SYBR GreenⅠ染料法通過建立質(zhì)粒標準品繪制標準曲線來實現(xiàn)Gfi1基因的絕對定量。SYBR greenⅠ是一種不對稱箐類熒光素，非特異地嵌合在DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的小溝內(nèi)，與雙鏈DNA結(jié)合后，熒光大大增強，當它從DNA雙鏈上釋放出來時，熒光迅速下降。因此，SYBR GreenⅠ產(chǎn)生的熒光信號強度代表了雙鏈DNA的數(shù)量，從而實現(xiàn)對特異性產(chǎn)物的鑒別和定量[6]。但是SYBR GreenⅠ沒有特異性，對PCR反應(yīng)中的非特異性擴增或引物二聚體也會結(jié)合產(chǎn)生熒光。如果結(jié)合熔解曲線，就能很好的判斷反應(yīng)的特異性。

本實驗采用SYBR GreenⅠ法成功建立了檢測人Gfi1mRNA的實時熒光定量PCR標準曲線，公式為y=-3.441x+40.314，斜率為-3.441，相關(guān)系數(shù)為0.996，研究者們通過實踐總結(jié)提出斜率在-3.0～-3.9，相關(guān)系數(shù)＞0.95的標準曲線已是比較滿意的實驗結(jié)果[7]，每個梯度濃度的標準品質(zhì)粒均呈現(xiàn)典型的S形動力學(xué)曲線，可見本實驗體系線性范圍廣，可達 7 個 log 值的范圍 (6.36×102～6.36×108copies/μl)，敏感性高，起始拷貝數(shù)在6.36×102copies/μl就可獲得良好的定量效果，而普通的PCR檢測至少要6.36×104copies/μl才能檢測得到。熔解曲線分析顯示在90℃左右有一單一的峰，峰的形狀銳利，說明引物的特異性好。為對樣品進行準確定量奠定了良好的基礎(chǔ)。

通過對標準品進行的重復(fù)性實驗，我們了解每個稀釋度標準品的Ct值基本恒定，批內(nèi)和批間變異系數(shù)分別為1.35%～3.61%和1.49%～3.42%，說明本實驗體系有較好的重復(fù)性與穩(wěn)定性，而且采用重組質(zhì)粒作為標準品可以長期穩(wěn)定保存，與目的基因同源性高，兩者擴增效率一致確保定量結(jié)果可靠。

本研究以plox-Gfi1質(zhì)粒為模板，建立了SYBR GreenⅠ實時熒光PCR定量的實驗方法與反應(yīng)體系，該法快速有效、靈敏度高、特異性好，Ct值線性范圍廣，可重復(fù)性好，為Gfi1基因的進一步研究提供了可靠手段。

[1]Gilks CB,Bear SE,Grimes HL,et al.Progression of interleukin-2(IL-2)-dependent rat T cell lymphoma lines to IL-2-independent growth following activation of a gene(Gfi-1)encoding a novel zinc finger protein[J].Mol Cell Biol,1993,13(3):1759-1768.

[2]Schmidt T,Karsunky H,Gau E,et al.Zinc finger protein GFI-1 has low oncogenic potential but cooperates strongly with pim and myc genes in T-cell lymphomagenesis[J].Oncogene,1998,17(20):2661-2667.

[3]Grimes HL,Chan TO,Zweidler-McKay PA,et al.The Gfi-1 protooncoprotein contains a novel transcriptional repressor domain,SNAG,and inhibits G1 arrest induced by interleukin-2 withdrawal[J].Mol Cell Biol,1996,16(11):6263-6272.

[4]Zornig M,Schmidt T,Karsunky H,et al.Zinc finger protein GFI-1 cooperates with myc and pim-1 in T-cell lymphomagenesis by reducing the requirements for IL-2[J].Oncogene,1996,12(8):1789-1801.

[5]Huh HJ,Chae SL,Lee M,et al.CD34,RAB20,PU.1 and GFI1 mRNA expression in myelodysplastic syndrome[J].Int JLab Hematol,2009,31(3):344-351.

[6]Yin JL,Shackel NA,Zekry A,et al.Real-time reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR)formeasurement of cytokine and growth factor mRNA expression with fluorogenic probes or SYBR GreenⅠ[J].Immunol Cell Biol,2001,79(3):213-221.

[7]van der Velden VH,HochhausA,Cazzaniga G,et al.Detection of minimal residual disease in hematologic malignancies by real-time quantitative PCR:principles,approaches,and laboratory aspects[J].Leukemia,2003,17(6):1013-1034.