鄭愛娟 劉國華 董曉玲 李 勇 陳桂蘭

小肽是氨基酸吸收的主要形式，飼糧中的大部分氨基酸是以小肽的形式通過依賴于H+的Ⅰ型小肽轉運載體(PepT1)在小腸內(nèi)被吸收。研究表明，動物小腸(或腸細胞)對肽的吸收受飼糧和營養(yǎng)［1-6］、饑餓［7-9］、腸道損傷［10-11］、燒傷［12］、缺氧［13］、晝夜變化［14］等多種因素的影響，其中大部分因素是通過影響PepT1 mRNA表達而起作用。至今尚未詳細了解其作用途徑，但鑒于多種激素和活性因子都在物質跨膜轉運中發(fā)揮著配體(第一信使)作用，因此研究激素和活性因子對PepT1 mRNA表達的影響將有助于揭示肽轉運調(diào)控的生理和生化機制。目前已經(jīng)報道了胰島素［15-17］、生長激素［12-13］、表皮生長因子(EGF)［15，18］、腎上腺素受體激動劑［19］、瘦素［20］和三碘甲狀腺原氨酸(T3)［21］對肽轉運的影響，并對肽轉運系統(tǒng)的調(diào)控機制進行了初步探討。但現(xiàn)有的研究報道大部分是以哺乳動物細胞或轉基因細胞為模型，而以禽類為動物模型的研究尚不多見。本試驗擬通過研究甲狀腺素、胰高血糖素(pancreas glucagon，PG)和EGF對肉雞小腸PepT1 mRNA表達的影響，為探討肽轉運載體調(diào)控機制，進一步揭示肉雞對小肽的吸收轉運機理奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

左旋甲狀腺素鈉(T4，天津赫素制藥有限公司)、PG(Sigma Aldrich公司)、EGF(Sigma Aldrich公司)、甲巰咪唑(methimazole，北京雙橋制藥公司)。

1.2 試驗動物及飼養(yǎng)管理

選用50只1日齡健康雄性肉仔雞，按常規(guī)飼養(yǎng)管理至25日齡，為預試期。期間自由采食玉米-豆粕型飼糧，自由飲水，24 h光照。1日齡注射接種馬立克氏疫苗，7日齡滴鼻接種新城疫弱毒-腎傳支二聯(lián)疫苗。

1.3 試驗設計

預試期后，從上述肉雞中選擇體重無差異的25日齡雄性肉仔雞30只，分為5組，每組6只雞，分別接受不同激素處理，每天1次，連續(xù)5 d。對照組、EGF組、PG組分別皮下注射蒸餾水0.20 mL/kg、EGF 0.03 mg/kg、PG 0.10 mg/kg;T4組、TH 組分別灌服 T4330.00 μg/kg、甲巰咪唑(抗甲狀腺藥物)25.00 mg/kg，同時皮下注射蒸餾水 0.20 mL/kg。

T4參照大鼠甲亢模型［22］的劑量給藥，PG參照大鼠外源PG試驗模型［23］的劑量給藥，EGF參照多器官功能障礙綜合征(MODS)小鼠模型治療有效劑量［24］給藥，甲巰咪唑參照甲狀腺功能減退癥大鼠模型［25］的劑量給藥。

試驗雞接受最后1次處理12 h后采血，制備血清;乙醚麻醉后宰殺，取十二指腸、空腸、回腸中段各1 cm，用冷生理鹽水沖洗腸段后液氮速凍，放入超低溫冰箱保存待測。

1.4 指標及測定方法

1.4.1 血清 T3、人表皮生長因子(h-EGF)和 PG含量測定

血清T3、h-EGF和PG含量分別采用T3放免試劑盒(HY-03)、h-EGF放免試劑盒(HY-058)和PG放免試劑盒(HY-039)測定。試劑盒均為北京華英生物技術研究所產(chǎn)品。計數(shù)器采用GC-911型γ放免計數(shù)器(中國科大光電儀器中佳分公司)。

1.4.2 小腸PepT1 mRNA表達量測定

采用離心柱型總RNA提取試劑盒(RNAultra，北京天為時代科技有限公司產(chǎn)品)提取腸組織總RNA，然后進行反轉錄。參考 PepT1基因［AY029615(2 914 bp)］序列設計特異性引物，上游引物為:5'-TAGACTGGGCAAGCGTCTT-3'，下游引物為:5'-TTTGCAACGACGACGAGAA-3'，產(chǎn)物長度為347 bp;內(nèi)參基因β-肌動蛋白(β-actin)上游引物為:5'-TGAACAAGCCCAGAGGTTT-3'，下游引物為:5'-ATCTAAGAACGGATACCTCAGG-3'，產(chǎn)物長度為649 bp。引物由上海生工生物技術有限公司合成。

使用PCR儀(Gene Amp PCR system 9700型，美國Applied Biosystem公司)進行PCR擴增。反應體系為:cDNA模板和Taq DNA聚合酶各1μL，10×PCR buffer 5 μL，dNTP(10 mmol/L)4 μL，MgSO4(100 mmol/L)0.25 μL，上 下 游 引 物(10μmol/L)各1μL，加無菌蒸餾水至50μL。

擴增條件為:94℃預變性5 min，94℃變性30 s，56 ℃ 退火 30 s，72 ℃ 延伸 45 s，29 個循環(huán)，72℃延伸5 min。溴化乙錠染色，電泳儀(DYY-Ⅲ31A型，北京市六一儀器廠)電泳，紫外凝膠分析儀拍照，采用Bio-1D++(法國Vilber Lourmat公司)軟件分析結果，計算PepT1 mRNA的相對表達量。

1.5 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析

采用Statistica 6.0統(tǒng)計軟件One-way ANOVA程序進行單因素方差分析，F(xiàn)isher’s LSD法多重比較，以 P＜0.05、P ＜0.01分別作為差異顯著和極顯著標準。

2 結果

2.1 雞血清 h-EGF、T 3、PG 含量

由表1可知，連續(xù)5 d皮下注射EGF和PG對血清中h-EGF和PG含量無顯著影響(P＞0.05);口服T4顯著提高血清T3含量(P＜0.05)，口服甲巰咪唑則顯著降低血清T3含量(P＜0.05)。

2.2 雞小腸Pep T1 mRNA表達量

由圖1和表2可知，不同激素處理對雞小腸PepT1 mRNA表達量有顯著影響(P＜0.05)。皮下注射PG(P ＜0.05)和口服T4(P ＜0.01)均顯著提高了雞小腸各腸段PepT1 mRNA表達量平均值，表明二者對雞小腸PepT1 mRNA表達有上調(diào)作用，其中以T4的上調(diào)作用更為明顯。皮下注射EGF和口服甲巰咪唑有降低PepT1 mRNA表達量的趨勢，但均未達到顯著水平(P＞0.05)。

3 討論

3.1 甲狀腺素對雞小腸Pep T1 mRNA表達的調(diào)控

甲狀腺素的主要功能是維持動物正常生長發(fā)育、保持正常體溫和能量代謝，其生理功能主要是通過與細胞核受體結合、加速mRNA形成并促進蛋白質合成。已知動物細胞內(nèi)存在著一類DNA轉錄調(diào)節(jié)型受體系統(tǒng)，該類受體與甲狀腺素和類固醇激素結合，激活mRNA的轉錄和轉運蛋白的表達。Matosin-Matekalo等［26］報道，T3處理的Caco-2/TC7克隆細胞對葡萄糖的吸收提高了10倍，葡萄糖轉運蛋白(SGLT1)mRNA表達量也隨T3劑量的提高而提高，Na+，K+-ATP酶含量也有明顯增加。另有研究同樣發(fā)現(xiàn)，T3處理也以劑量依賴的方式提高葡萄糖轉運蛋白(GLUT5)mRNA表達量［27］。關于甲狀腺素對PepT1 mRNA表達影響機制的研究還未見報道。

表1 EGF、PG和T 4對雞血清相應激素含量的影響Table 1 Effects of EGF，PG and T4 on contents of according hormones in serum of broilers

圖1 雞小腸Pep T1和β－肌動蛋白基因RT-PCR產(chǎn)物電泳圖譜Fig.1 Electrophoretogram of the RT-PCR products of PepT1 andβ-actin gene in small intestine of broilers

本次試驗中連續(xù)5 d口服T4顯著提高血清T3水平，并在轉錄水平上顯著上調(diào)了PepT1 mRNA表達;而連續(xù)5 d口服甲狀腺抑制劑則顯著降低血清T3水平，PepT1 mRNA表達略低于對照組;表明T3水平與PepT1 mRNA表達之間存在一定的劑量依賴關系。這些結果表明，DNA轉錄調(diào)節(jié)型受體系統(tǒng)可能是調(diào)控肽轉運系統(tǒng)信號過膜傳導的途徑之一。但據(jù)Ashida等［21］報道，T3處理在促進甲酰葡萄糖苷和蘇氨酸吸收的同時，卻抑制了Caco-2細胞對甘氨酰肌氨酸(Gly-Sar)的吸收，并降低了PepT1 mRNA表達量和PepT1蛋白含量，與本試驗結果不一致，可能與哺乳動物和鳥類以及體組織和離體培養(yǎng)細胞之間的差異有關。

3.2 EGF對雞小腸Pep T1 mRNA表達的調(diào)控

EGF是一類重要的生長因子，它是由50～60個氨基酸分子組成的多肽類活性物質。其主要功能是促進間質及上皮細胞增殖和分化，促進成纖維細胞和內(nèi)皮細胞增殖，在體內(nèi)介導上皮生長，促進血管形成，抑制胃酸分泌，加速傷口愈合等。近年來研究表明，EGF在腸道營養(yǎng)物質吸收方面也發(fā)揮著重要作用。

EGF具有調(diào)控肽轉運系統(tǒng)的作用。Nielsen等［18］報道，EGF長期(26～28 d)培養(yǎng) Caco-2 細胞使其Gly-Sar轉運量降低約50%，轉運最大速率降低90%，同時PepT1 mRNA表達量和細胞膜PepT1蛋白含量都明顯降低，表明EGF是通過下調(diào)PepT1 mRNA表達降低細胞二肽轉運能力的。另外，Nielsen等［15］發(fā)現(xiàn) EGF 短期(5 min)刺激即能增加Caco-2細胞攝取Gly-Ser的能力，并于10～20 min后達到平臺期，轉運最大速率提高了約50%，但并未影響PepT1 mRNA表達量和H+濃度，同時其促轉運作用未受蛋白轉運抑制劑(brefeldin A)的影響，表明 EGF處理不會影響PepT1蛋白的合成。

表2 EGF、PG和T 4對雞小腸PepT1 mRNA表達量的影響Table 2 Effects of EGF，PG and T4 on the expression level of PepT1 mRNA in the small intestine of broilers

本試驗未能觀察到注射EGF對其在血清中含量和PepT1 mRNA表達量的顯著作用，可能是本試驗所用的h-EGF與雞的表皮生長因子受體(EGFR)親和力較差(人類和雞的EGFR同源性為75%)，掩蓋了EGF的作用，也有可能與藥劑量較低有關。但PepT1 mRNA表達量有降低的趨勢，與上述文獻報道中長期效應的研究結果一致。

3.3 PG對雞小腸Pep T1 mRNA表達的調(diào)控

PG是由胰島細胞分泌的一種多肽激素。其主要功能是促進糖原分解和糖異生作用，使血糖升高。其作用是通過環(huán)腺苷酸-蛋白激酶A(cAMP-PKA)系統(tǒng)，激活肝細胞的磷酸化酶，加速糖原分解。此外，PG也能以腸細胞作為靶細胞，促進營養(yǎng)物質的吸收［28］。Thompson 等［29］在大鼠腹腔注射PG顯著增加空腸細胞刷狀緣膜電位，使葡萄糖和半乳糖的吸收提高50%以上，并可能增加纈氨酸的吸收。Debnam等［30］報道了PG可以直接作用于大鼠空腸上皮細胞，促進刷狀緣膜微囊和基底膜微囊對半乳糖的吸收。而迄今關于PG與肽轉運之間的聯(lián)系仍未見研究報道。此外，現(xiàn)有報道中也未發(fā)現(xiàn)PG對營養(yǎng)吸收相關基因表達的影響。

本試驗中，注射PG并未顯著影響其在血清中含量，可能與PG極短的半衰期(5～10 min)有關。但每天1次的PG注射仍然影響了雞小腸PepT1 mRNA表達量，在轉錄水平上上調(diào)了PepT1 mRNA表達量，顯然PG具有促進雞小肽吸收轉運的潛力。但其是否確實存在該生理功能仍需進一步研究證實。

4 結論

①口服T4、甲巰咪唑分別顯著提高、顯著降低血清T3含量。

②皮下注射PG和口服T4均顯著提高了雞小腸PepT1 mRNA表達量，而皮下注射EGF和口服甲巰咪唑對其無顯著影響。

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