房天琪， 邱芳萍， 王長周， 季曉楓

(長春工業(yè)大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，吉林長春 130012)

0 引 言

蛹蟲草(Cordyceps militaris)又名北冬蟲夏草、北蟲草等，是著名的食藥用菌，具有較高的食藥用價(jià)值[1]，近年來，隨著野生冬蟲夏草資源逐漸枯竭，價(jià)格不斷上漲，人們把目光瞄準(zhǔn)了用人工培育的蛹蟲草作為冬蟲夏草的替代品[2]。有研究表明，人工培育蛹蟲草的菌絲體和子實(shí)體具有相似的藥用與滋補(bǔ)功效[3]。因此，采用液體發(fā)酵獲得的菌絲體代替子實(shí)體生產(chǎn)各種藥用和保鍵產(chǎn)品成為目前冬蟲夏草市場亟待解決的問題[4]。本研究通過響應(yīng)面分析法與PB實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的方法，以菌絲體生長量為響應(yīng)值[5]，采用多元二次回歸擬合方程[6]，并通過求偏導(dǎo)獲得了主要影響因子的最佳濃度配比[7]。蛹蟲草液體培養(yǎng)進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)研究，對(duì)蟲草產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有一定的理論與實(shí)際意義[8]。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 菌種

蛹蟲草菌(Cordycepsm ilitaris)，由吉林蠶業(yè)研究所提供。

1.2 斜面培養(yǎng)基組成

每1 L培養(yǎng)基中含有:馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蛋白胨 20 g，KH 2 PO4 1.0 g，MgSO4?7H 2O 0.5 g，瓊脂20 g，pH自然。

1.3 種子培養(yǎng)基

每1 L培養(yǎng)基中含:土豆200 g，胡蘿卜200 g，葡萄糖20 g，蛋白胨20 g，KH2PO41.0 g，MgSO4?7H 2O 1.0 g，維生素B1 1.0 g。

1.4 試劑

其它試劑均為分析純，長春金星化學(xué)與生物制劑有限公司購買。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 培養(yǎng)方法

將制備的供試液體培養(yǎng)基各取100 m L，分別裝入250m L的三角瓶中，經(jīng)高壓蒸汽滅菌，在無菌操作臺(tái)上接入1塊0.5 cm2菌種塊，放入恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，在25℃，150 r/min的條件下振蕩培養(yǎng)3 d，得到帶有菌絲體球的種子液，以一定接種量轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)液中，相同條件下培養(yǎng)2 d，得發(fā)酵液。

2.2 菌絲體生長量的測(cè)定

將發(fā)酵液中的菌絲體放于離心機(jī)中離心，轉(zhuǎn)速設(shè)定為4 000 r/m in，時(shí)間15min，棄上清液，以去離子水洗滌沉淀3次，干燥至恒重，即得菌絲體干重。

2.3 Placket t2Burman(PB)設(shè)計(jì)

通過預(yù)實(shí)驗(yàn)(碳源考察和氮源考察)選擇對(duì)蛹蟲草菌絲體干重有正效應(yīng)的影響因素，對(duì)培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)條件進(jìn)行考察，篩選影響蟲草菌絲體產(chǎn)量的重要因素，確定最優(yōu)培養(yǎng)基及最適培養(yǎng)條件，其試驗(yàn)因素、水平見表1。

表1 PB試驗(yàn)因素與水平 (g/L)

試驗(yàn)設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)分析和模型建立皆由M ini Tab 16輔助完成。

2.4 中心組合設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析

根據(jù)Box2W il son的中心組合設(shè)計(jì)原理，以最陡爬坡試驗(yàn)得到的中心點(diǎn)，對(duì)PB試驗(yàn)確定的顯著因素安排響應(yīng)面分析試驗(yàn)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)分析和模型建立皆由Design-Expert 7.0.0輔助完成。

2.5 生長曲線的測(cè)定

采用比濁法測(cè)定蟲草菌的生長曲線，以發(fā)酵時(shí)間與OD600之間的關(guān)系繪制菌絲體生長曲線。

3 結(jié)果與分析

3.1 蛹蟲草液體培養(yǎng)基最佳碳源以及氮源的確定

圖1 蛹蟲草液體培養(yǎng)最佳碳源的選擇

蛹蟲草液體培養(yǎng)基最佳碳源以及氮源的選擇分別如圖1和圖2所示。由圖1和圖2可知，以蛹蟲草菌絲體干重為指標(biāo)，確定最佳碳源為葡萄糖，最佳氮源為玉米漿。

3.2 PB試驗(yàn)結(jié)果

圖2 蛹蟲草液體培養(yǎng)最佳氮源的選擇

通過PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，用M initab軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到各因素對(duì)響應(yīng)值Y(菌絲體干重，g/L)的影響效果見表2。

表2 因素影響效果分析

同時(shí)得到一次回歸方程為:

根據(jù)表2中的檢驗(yàn)結(jié)果可知，在99%置信區(qū)間內(nèi)，葡萄糖和玉米漿的可信度分別為99.33%和99.48%，該方程的決定系數(shù)R2為98.20%，表明該回歸方程擬合良好，可應(yīng)用于分析和預(yù)測(cè)發(fā)酵過程中蛹蟲草菌絲體的產(chǎn)量。

3.3 中心組合設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析

響應(yīng)值維持原始水平不變，根據(jù)爬坡試驗(yàn)得到的中心點(diǎn)，對(duì)X1，X2，X3，X7進(jìn)行中心試驗(yàn)組合設(shè)計(jì)。為使擬合方程具有旋轉(zhuǎn)性和通用性，中心點(diǎn)重復(fù)5次，星號(hào)臂長γ=1.414。通過自變量水平及編碼試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果，再利用Design-Expert中的響應(yīng)面回歸命令對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到二次回歸方程各因子的偏回歸系數(shù)估計(jì)值及方差分析結(jié)果見表3。

表3 回歸方程中回歸系數(shù)的估計(jì)值及方差分析

續(xù)表3

由表3得到預(yù)測(cè)菌絲體生物量的回歸方程，對(duì)回歸方程各項(xiàng)進(jìn)行方差分析可知，回歸方程中包含6個(gè)顯著項(xiàng):A，C，D，AC，BC，CD，A2，B2，D2這9個(gè)顯著項(xiàng)的Pr＞|t|的概率均小于0.05，得出該方程的相關(guān)系數(shù)R=0.982 0，說明該方程回歸效果顯著，模型可信度高，試驗(yàn)因子對(duì)響應(yīng)值的影響可用回歸方程表示為:

響應(yīng)面分析法(X1，X2，X3，X7)立體分析圖和相應(yīng)的等高線圖如圖3所示。

圖3 響應(yīng)面分析法(X 1，X 2，X3，X7)立體分析圖和相應(yīng)的等高線圖

圖3表明，在所選因素水平范圍內(nèi)，均有最大響應(yīng)值出現(xiàn)，通過數(shù)學(xué)模型預(yù)測(cè)最優(yōu)的培養(yǎng)條件為:葡萄糖濃度 23.34 g/L，玉米漿濃度25.5 m L/L，接菌量9%，發(fā)酵溫度25℃的條件下，菌絲體生物量最大預(yù)測(cè)值為15.59 g/L。為了檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷臏?zhǔn)確性，對(duì)此進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，共進(jìn)行3批次重復(fù)試驗(yàn)，得到菌絲體生物量的平均值為15.56 g/L，可見該模型能很好地預(yù)測(cè)蟲草發(fā)酵情況。

3.4 測(cè)定最佳培養(yǎng)條件下蛹蟲草生長曲線

對(duì)最佳種子培養(yǎng)基進(jìn)行菌種的培養(yǎng)，每隔2 h取樣品測(cè)定發(fā)酵液中的菌體量，以時(shí)間與菌體量繪制生長曲線，如圖4所示。

圖4 蛹蟲草生長曲線

從圖4可以看出，菌種接入種子培養(yǎng)基0～28 h后，開始由生長延滯期進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，72 h菌量達(dá)到最高峰，120 h后，細(xì)胞量開始下降后，進(jìn)入靜止期。因此，接種種齡取72 h為宜。

4 結(jié) 語

試驗(yàn)表明，在所選的碳源中，葡萄糖最有利于蛹蟲草菌絲體的生長，玉米漿與無機(jī)氮源相比更易被蟲草菌絲體利用，通過PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)確立了最顯著影響因素分別為葡萄糖濃度、玉米漿濃度、接種量、培養(yǎng)時(shí)間，并通過響應(yīng)面軟件建立這4個(gè)因素和響應(yīng)值菌絲體生物量之間的數(shù)學(xué)模型，效果顯著，能很好地預(yù)測(cè)菌絲體的生物量。通過驗(yàn)證試驗(yàn)，在響應(yīng)面優(yōu)化后所獲得的實(shí)際值與預(yù)測(cè)值的最大響應(yīng)值間擬合程度良好，表明中心組合設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析法在培養(yǎng)基優(yōu)化方面的應(yīng)用具有實(shí)際指導(dǎo)意義。

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