呂曉杰 周廣東 馬俐君 劉 霞 曹誼林

增強(qiáng)型綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)染活細(xì)胞效率的研究

呂曉杰 周廣東 馬俐君 劉 霞 曹誼林

目的 研究影響增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP）逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)系統(tǒng)轉(zhuǎn)染活細(xì)胞效率的主要相關(guān)參數(shù)，建立一種穩(wěn)定高效的活細(xì)胞EGFP標(biāo)記技術(shù)。方法 培養(yǎng)、擴(kuò)增攜帶EGFP逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的包裝細(xì)胞PG13，分別于12 h、24 h、36 h和48 h收集病毒液，轉(zhuǎn)染骨髓基質(zhì)細(xì)胞（BMSCs），通過流式細(xì)胞儀和熒光顯微鏡檢測不同時間點病毒轉(zhuǎn)染效率。選擇轉(zhuǎn)染率最高時間點的病毒液，連續(xù)轉(zhuǎn)染BMSCs兩次，小劑量嘌呤霉素篩選6 h，觀察病毒轉(zhuǎn)染率及細(xì)胞活力。再以上述方法轉(zhuǎn)染脂肪基質(zhì)細(xì)胞（ADSCs）和成纖維細(xì)胞（FBs），觀察這種方法標(biāo)記其他干細(xì)胞或成熟分化細(xì)胞的可行性。結(jié)果 根據(jù)流式細(xì)胞儀及熒光顯微鏡觀察結(jié)果，24 h收集的病毒液轉(zhuǎn)染BMSCs效率最高（64.56±2.53）%，36 h次之（56.98±3.22）%，12 h（47.39±1.82）%與48 h（37.84±1.77）%相對較低。連續(xù)轉(zhuǎn)染兩次并經(jīng)短暫篩選后，BMSCs轉(zhuǎn)染率可達(dá)80%以上，且細(xì)胞活力不受影響。采用相同方法轉(zhuǎn)染脂肪基質(zhì)細(xì)胞（ADSCs）和成纖維細(xì)胞（FBs），轉(zhuǎn)染率均能達(dá)到80%，且細(xì)胞形態(tài)、增殖能力均未見明顯改變。結(jié)論 本實驗建立了一種穩(wěn)定高效的活細(xì)胞EGFP轉(zhuǎn)染技術(shù)，為研究組織工程種子細(xì)胞的體內(nèi)、外轉(zhuǎn)歸及細(xì)胞間相互作用提供了穩(wěn)定且直觀的檢測手段。

增強(qiáng)型綠色熒光蛋白 逆轉(zhuǎn)錄病毒 細(xì)胞標(biāo)記 組織工程

細(xì)胞標(biāo)記是研究組織工程種子細(xì)胞生物學(xué)行為必備的重要技術(shù)和工具，建立高效、穩(wěn)定、直觀、靈敏且檢測方便的細(xì)胞標(biāo)記技術(shù)，一直是組織工程種子細(xì)胞研究領(lǐng)域的重要課題。與其他細(xì)胞標(biāo)記方法相比，以逆轉(zhuǎn)錄病毒為載體的增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP）基因轉(zhuǎn)染[1-2]因同時具有穩(wěn)定(表達(dá)持久)、直觀、靈敏且檢測方便等諸多優(yōu)點，一直是首選的細(xì)胞標(biāo)記方法，特別是針對需要進(jìn)行體內(nèi)、外較長時期觀察活細(xì)胞分布、轉(zhuǎn)歸及細(xì)胞間相互作用的研究，更是最佳的細(xì)胞示蹤方法。但是，該方法轉(zhuǎn)染效率相對較低，長期篩選會損失大量目的細(xì)胞，并加快細(xì)胞老化，明顯影響細(xì)胞活力甚至改變細(xì)胞原有的生物學(xué)特性，嚴(yán)重限制了其應(yīng)用范圍。為解決上述問題，本實驗通過對影響EGFP逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)系統(tǒng)轉(zhuǎn)染效率主要相關(guān)參數(shù)進(jìn)行系統(tǒng)研究、比較與分析，初步建立了一種穩(wěn)定、高效的活細(xì)胞EGFP標(biāo)記技術(shù)，為組織工程種子細(xì)胞的體內(nèi)、外轉(zhuǎn)歸及細(xì)胞間相互作用研究提供穩(wěn)定、直觀的檢測手段。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗試劑

攜帶EGFP逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的包裝細(xì)胞PG13（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院馬俐君惠贈）；魚精蛋白、嘌呤霉素和Dispase（美國Sigma公司）；Ⅰ型膠原酶（美國Worthington公司）；DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；胎牛血清 （FBS）（美國Hyclone公司）；實驗動物為長楓雜交豬（上海川沙養(yǎng)殖場）。

1.1.2 實驗儀器

主要實驗儀器包括恒溫?fù)u床 （太倉華美生化儀器），倒置相差顯微鏡（日本Nikon公司），熒光顯微鏡（日本Olympus公司），流式細(xì)胞儀（美國Beckman Coulter公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 EGFP逆轉(zhuǎn)錄病毒液的收集和制備

凍存的含EGFP逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體的包裝細(xì)胞PG13快速置于37℃水浴復(fù)蘇，1 500 r/min離心5 min，棄上清，細(xì)胞沉淀重懸于含10%胎牛血清的DMEM中，以0．5×104cells/cm2的密度接種于100 mm培養(yǎng)皿，細(xì)胞貼壁生長達(dá)80%以上融合時，改用含20%胎牛血清的DMEM以相同密度傳代接種于20個培養(yǎng)皿（10 mL DMEM/皿），分別于12 h、24 h、36 h和48 h各收集5個培養(yǎng)皿的病毒上清，并加入魚精蛋白5 μg/mL，混合液經(jīng)0．45 μm無菌濾膜過濾收集于50 mL無菌離心管內(nèi),立即用于實驗或置-80℃中備用。

1.2.2 骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSCs)的分離、培養(yǎng)與擴(kuò)增

4～6周齡長楓雜交豬常規(guī)麻醉、消毒，無菌條件下抽取骨髓3～4 mL，置于肝素化無菌離心管中，加無血清DMEM 30 mL，充分混勻，2 000～3 000 r/min離心 10 min，輕輕吸除脂肪及大部分上清液，以含10%FBS的DMEM重懸下層細(xì)胞沉淀，細(xì)胞密度為6×105cells/cm2接種于100 mm培養(yǎng)皿內(nèi)，37℃、5% CO2、100%飽和濕度條件下，培養(yǎng)5～6 d首次換液，3～4 d后細(xì)胞可達(dá)80%融合，按1×104cells/cm2密度傳代于新的培養(yǎng)皿內(nèi)，繼續(xù)培養(yǎng)，傳至第二代的細(xì)胞接種于20個100 mm培養(yǎng)皿內(nèi)，達(dá)到對數(shù)生長期（約24 h）時，用于病毒轉(zhuǎn)染及效率測定，另外同樣方法培養(yǎng)5皿BMSCs作為未轉(zhuǎn)染對照組。

1.2.3 BMSCs中EGFP基因轉(zhuǎn)染及效率測定

將上述不同時間點（12 h、24 h、36 h和48 h）收集的PG13細(xì)胞上清病毒液各10 mL分別加入上述處于對數(shù)生長期的BMSCs中，每個時間點病毒液對應(yīng)5皿BMSCs，轉(zhuǎn)染12 h后，換成正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，于熒光顯微鏡下觀察EGFP的表達(dá)。分別收集同期培養(yǎng)的未轉(zhuǎn)染BMSCs及不同時間點病毒液轉(zhuǎn)染的BMSCs，以磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗2次，流式細(xì)胞儀定量檢測[3]各時間點收集的病毒液轉(zhuǎn)染BMSCs的EGFP陽性表達(dá)率，比較不同時間點的病毒液轉(zhuǎn)染效率，結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.2.4 BMSCs中EGFP基因轉(zhuǎn)染效率進(jìn)一步優(yōu)化

收集轉(zhuǎn)染率最高的時間點的PG13的病毒上清，分別轉(zhuǎn)染5皿BMSCs。具體的優(yōu)化方案為：連續(xù)轉(zhuǎn)染BMSCs兩次，即首次轉(zhuǎn)染12 h后，換成正常培養(yǎng)液，6 h后再次加入病毒上清轉(zhuǎn)染12 h，之后換成正常培養(yǎng)液培養(yǎng)，待細(xì)胞達(dá)到80%以上融合時，加入含嘌呤霉素3 μg/mL的DMEM培養(yǎng)液10 mL進(jìn)行篩選，篩選6 h后，換成正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，待再次達(dá)到80%融合時，熒光顯微鏡下觀察EGFP的表達(dá)情況，流式細(xì)胞儀測定BMSCs的EGFP陽性表達(dá)率，與單次轉(zhuǎn)染進(jìn)行比較，結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.2.5 脂肪基質(zhì)細(xì)胞（ADCs）培養(yǎng)及EGFP標(biāo)記

取整形外科抽脂患者（年齡 25～45歲）脂肪抽吸液100 mL，等量PBS清洗3遍，0.075%Ⅰ型膠原酶37℃消化30 min，1 380 r/min離心10 min，棄上清，細(xì)胞沉淀重懸于含10%胎牛血清的DMEM中，吸取少量細(xì)胞懸液用4%乙酸等體積稀釋，常規(guī)計數(shù)有核細(xì)胞數(shù)，100 mm培養(yǎng)皿每皿接種約1×106個細(xì)胞，置于37℃、5%CO2、100%飽和濕度的條件下培養(yǎng)24 h后，首次換液。細(xì)胞達(dá)80%融合后，胰酶消化，按1×104cells/cm2密度傳代，傳至第2代的細(xì)胞達(dá)到對數(shù)生長期（約24 h）時，按優(yōu)化后的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染、篩選并測定轉(zhuǎn)染陽性率。

1.2.6 皮膚成纖維細(xì)胞（FBs）培養(yǎng)及EGFP標(biāo)記

取泌尿外科患兒（10歲以下）包皮1 cm×1 cm，置于無菌離心管中，PBS清洗 2次，0.6 U/mL的Dispase 4℃消化過夜，去除表皮，將真皮于無菌條件下充分剪碎，以0.15%膠原酶37℃消化4 h，無菌濾網(wǎng)過濾后，2 000～3 000 r/min離心10 min，棄上清，細(xì)胞沉淀重懸于含10%胎牛血清的DMEM中，按1×104cells/cm2密度接種于100 mm培養(yǎng)皿，37℃，5%CO2、100%飽和濕度下培養(yǎng)過夜，細(xì)胞達(dá)80%融合后，按0.5×104cells/cm2密度傳代培養(yǎng)，傳至第2代細(xì)胞達(dá)到對數(shù)生長期（約24 h）時，按優(yōu)化后的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染、篩選并測定轉(zhuǎn)染陽性率。

2 結(jié)果

2.1 PG13細(xì)胞的培養(yǎng)和擴(kuò)增

包裝細(xì)胞PG13呈短梭形或三角形，胞漿內(nèi)充滿粗大顆粒。在熒光顯微鏡藍(lán)光激發(fā)下，PG13表達(dá)的EGFP能夠產(chǎn)生明亮的綠光。分別于不同時間點觀察PG13的生長狀況及熒光強(qiáng)度變化，可見隨著接種時間延長，PG13密度逐漸增加，約24 h達(dá)到對數(shù)增長期，48 h完全融合。同時，熒光強(qiáng)度也隨時間延長而逐漸增加（圖1）。

2.2 不同時間點病毒液轉(zhuǎn)染BMSCs后EGFP表達(dá)的熒光觀察

未轉(zhuǎn)染的BMSCs呈梭形或扁平形。各時間點收集的病毒液轉(zhuǎn)染BMSCs后，均出現(xiàn)EGFP陽性細(xì)胞，其中24 h和36 h的陽性細(xì)胞數(shù)明顯多于48 h和12 h，說明24 h和36 h收集的病毒液轉(zhuǎn)染效率較高，而48 h和12 h較低（圖2）。

2.3 不同時間點病毒液轉(zhuǎn)染BMSCs，EGFP表達(dá)的流式分析

流式細(xì)胞儀定量分析結(jié)果表明，24 h收集病毒液轉(zhuǎn)染BMSCs后EGFP表達(dá)陽性率最高，為（64.56± 2.53）%；36 h組略低，為（56.98±3.22）%；12 h與48 h組相對較低，為別為（47.39±1.82）%和（37.84±1.77）%。結(jié)果表明，各組轉(zhuǎn)染率之間存在顯著差異（P<0.05）。轉(zhuǎn)染陽性細(xì)胞與陰性細(xì)胞分別形成兩個熒光，表達(dá)不同的群體（圖3）。

2.4 BMSC中EGFP基因轉(zhuǎn)染效率的優(yōu)化

經(jīng)兩次轉(zhuǎn)染和一次短暫篩選后，熒光觀察EGFP陽性細(xì)胞比例較一次轉(zhuǎn)染時明顯增多，流式測定結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染陽性率達(dá)（80.94±1.45）%。統(tǒng)計學(xué)分析表明，該優(yōu)化方法的轉(zhuǎn)染率比一次轉(zhuǎn)染率顯著增高（P<0.05），而且細(xì)胞活力及增殖狀態(tài)與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比無顯著差別。說明該方法在提高轉(zhuǎn)染效率的同時，并不會明顯影響細(xì)胞的正常生長代謝和生物學(xué)特性（圖4）。

2.5 ADSCs和FBs的EGFP標(biāo)記結(jié)果

按優(yōu)化的轉(zhuǎn)染方法，經(jīng)過兩次轉(zhuǎn)染和一次短暫篩選后，ADSCs和FBs的EGFP陽性表達(dá)率與BMSCs結(jié)果相似，且細(xì)胞形態(tài)、增殖能力等均未受明顯影響，說明該方法可以適用于其他干細(xì)胞或成熟分化細(xì)胞（圖5）。

圖1 EGFP逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞PG13在不同時間點的生長狀況（100×）Fig.1 Growth and morphology of PG13,the packing cell of EGFP retrovirus,at the different time(100×)

圖2 不同時間點病毒液轉(zhuǎn)染BMSCs后EGFP陽性表達(dá)率的熒光觀察（100×）Fig.2 Fluorescent observation of expression rates of EGFP,after BMSCs were transfected by the retrovirus supernatant at different time(100×)

圖3 不同時間點病毒液轉(zhuǎn)染BMSCs后EGFP陽性表達(dá)率的流式分析Fig.3 Flow analysis of expression rates of EGFP,after BMSCs were transfected by the retrovirus supernatant at different time

圖4 以優(yōu)化方法轉(zhuǎn)染BMSCs，EGFP陽性表達(dá)率的熒光觀察（40×）和流式分析Fig.4 Fluorescent observation and flow analysis of expression rates of EGFP,after BMSCs were transfected using the optimal method(40×)

3 討論

細(xì)胞標(biāo)記一直是組織工程種子細(xì)胞研究的重要課題，對于明確構(gòu)建組織的細(xì)胞來源以及植入體內(nèi)后種子細(xì)胞的分布、分化、最終轉(zhuǎn)歸及其與宿主細(xì)胞間的相互作用機(jī)制等具有重要意義。目前常用的細(xì)胞標(biāo)記方法很多，但每種標(biāo)記方法均有其各自的優(yōu)缺點，如：染色標(biāo)記法持續(xù)時間短、衰減快；β半乳糖苷酶（β-Gal、LacZ）基因轉(zhuǎn)染率低、檢測困難；BrdU標(biāo)記法作用時間短，濃度高時易損傷細(xì)胞等。與這些方法相比，以逆轉(zhuǎn)錄病毒為載體的綠色熒光蛋白（GFP）基因轉(zhuǎn)染具有明顯的優(yōu)勢[4－5]，標(biāo)記成功后可直接通過熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀直觀、靈敏地檢測活細(xì)胞的陽性細(xì)胞率。更重要的是，標(biāo)記細(xì)胞體外擴(kuò)增后，熒光強(qiáng)度不變而數(shù)量增多，植入體內(nèi)也會永久表達(dá)EGFP。因此，該方法具有穩(wěn)定、直觀、靈敏且檢測方便等諸多優(yōu)點，成為組織工程領(lǐng)域研究種子細(xì)胞分布、轉(zhuǎn)歸及細(xì)胞間相互作用的首選細(xì)胞標(biāo)記方法[6]。但該方法也存在明顯不足，其中最大的問題就是轉(zhuǎn)染效率相對較低，尤其是對于靜止期細(xì)胞和增殖能力較低的細(xì)胞，幾乎很難將EGFP基因轉(zhuǎn)入。細(xì)胞篩選雖然可以顯著提高陽性細(xì)胞率，但長期篩選會損失大量目的細(xì)胞，并加快細(xì)胞老化，明顯影響細(xì)胞活力甚至改變細(xì)胞原有的生物學(xué)特性，這些問題嚴(yán)重限制了其應(yīng)用范圍。本實驗試圖在提高EGFP逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)系統(tǒng)轉(zhuǎn)染效率的同時，盡量保證轉(zhuǎn)染后細(xì)胞仍具有原來的增殖活力和生物學(xué)特性。

大量研究表明，逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染效率受包裝細(xì)胞質(zhì)量、血清濃度、病毒滴度、病毒收集時間、轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞時機(jī)、轉(zhuǎn)染時間及篩選時間等諸多因素的影響，只有優(yōu)化組合這些相關(guān)參數(shù)，才能得到較高的病毒轉(zhuǎn)染效率并維持目的細(xì)胞的正常生長代謝[7-8]。在實驗中我們發(fā)現(xiàn)，病毒轉(zhuǎn)染率較低的問題主要與包裝細(xì)胞質(zhì)量不佳、病毒收集時間不當(dāng)、目的細(xì)胞未處于增殖期等有關(guān)，致使一次轉(zhuǎn)染率普遍不高。隨后進(jìn)行的長期篩選，雖然能夠大幅提高轉(zhuǎn)染率，但細(xì)胞的活力和功能受到極大影響。因此，篩選后的細(xì)胞普遍存在增殖能力差、細(xì)胞老化和生物特性改變等現(xiàn)象，某些篩選后干細(xì)胞甚至喪失部分或全部分化潛能，無法進(jìn)行組織工程種子細(xì)胞特性方面的研究。我們認(rèn)為，解決上述問題的最根本措施是提高病毒首次轉(zhuǎn)染效率，這就要求將包裝細(xì)胞和目的細(xì)胞都調(diào)整到最佳狀態(tài)，在病毒滴度最高時轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞。若要進(jìn)一步提高轉(zhuǎn)染率，可做二次轉(zhuǎn)染，必要時行短暫篩選，但絕對不可大劑量、長期篩選，以免細(xì)胞活力明顯下降，造成轉(zhuǎn)染失敗。

本實驗在包裝細(xì)胞PG13復(fù)蘇早期，便對細(xì)胞狀態(tài)進(jìn)行調(diào)整，并選擇應(yīng)用20%的胎牛血清，以0.5×104cells/cm2的接種密度對PG13進(jìn)行培養(yǎng)擴(kuò)增，盡量爭取在接種24 h時達(dá)到對數(shù)生長期，48 h時基本融合。這樣除了能在細(xì)胞增殖最旺盛時獲得大量病毒液外，還能保證細(xì)胞融合后，病毒液仍然具有充足營養(yǎng)，以利于日后的轉(zhuǎn)染。此外，被標(biāo)記目的細(xì)胞的生長狀態(tài)也是影響轉(zhuǎn)染效率的重要因素。我們在準(zhǔn)備目的細(xì)胞前，通過預(yù)實驗確定了接種的最佳濃度，使之在傳代后24 h時達(dá)到對數(shù)生長期，讓大多數(shù)細(xì)胞在轉(zhuǎn)染期內(nèi)完成有絲分裂，從而提高轉(zhuǎn)染效率。這些因素的優(yōu)化是本實驗?zāi)軌蝻@著提高轉(zhuǎn)染效率的基本前提。

在優(yōu)選了這些基本轉(zhuǎn)染條件后，最重要的問題就是如何確定收集病毒液的最佳時間。因為包裝細(xì)胞擴(kuò)增過程中培養(yǎng)液中的病毒滴度會隨細(xì)胞增殖而不斷升高，但同時培養(yǎng)液的營養(yǎng)條件也不斷下降。病毒滴度上升顯然有利于提高轉(zhuǎn)染率，但營養(yǎng)條件下降不利于目的細(xì)胞增殖，從而不利于提高轉(zhuǎn)染率。因此，選擇一個既能保證具有較高的病毒滴度，又具有良好的營養(yǎng)條件的病毒液收集時間點至關(guān)重要。本實驗中，我們系統(tǒng)地比較了不同時間點(12 h、24 h、36 h和48 h)收集病毒上清對BMSCs轉(zhuǎn)染效率的影響。結(jié)果表明，24 h收集的病毒液轉(zhuǎn)染效率最高，一次轉(zhuǎn)染的陽性率已超過60%，明顯高于以往報道的結(jié)果，說明24 h時，PG13細(xì)胞分泌的病毒數(shù)量與營養(yǎng)水平之間達(dá)到了相對平衡。36 h和48 h收集的病毒液雖然病毒滴度可能高于24 h，但其培養(yǎng)液的營養(yǎng)條件下降，所以轉(zhuǎn)染率也隨之下降，而對12 h的病毒液來講，盡管其培養(yǎng)條件最好，但因為病毒滴度太低也不利于轉(zhuǎn)染效率的提高，這與我們預(yù)想的結(jié)果基本一致。

為進(jìn)一步提高轉(zhuǎn)染率，本實驗還嘗試對目的細(xì)胞進(jìn)行再次轉(zhuǎn)染，兩次轉(zhuǎn)染時間僅相差6 h，以免間隔時間過長，目的細(xì)胞融合發(fā)生接觸抑制，影響轉(zhuǎn)染效果。根據(jù)我們的觀察結(jié)果，按照以上方法對目的細(xì)胞進(jìn)行兩次轉(zhuǎn)染后，即能達(dá)到較高轉(zhuǎn)染率 （70%以上），對于一般的研究來講已不必再作篩選。若選用小劑量嘌呤霉素作短暫篩選（6 h以內(nèi)），通常情況下也不會對目的細(xì)胞造成太大影響，并且最終可使轉(zhuǎn)染率達(dá)到80%以上，完全能夠滿足組織工程對標(biāo)記后種子細(xì)胞陽性率和功能方面的要求。為較全面地明確這種優(yōu)化的細(xì)胞標(biāo)記技術(shù)在其他細(xì)胞中應(yīng)用的可行性，我們又對組織工程中較為常用的ADSCs、FBs進(jìn)行同樣的EGFP基因轉(zhuǎn)染標(biāo)記。初步結(jié)果表明，該技術(shù)完全適用于其他干細(xì)胞或成熟分化細(xì)胞，說明本實驗建立的方法具有普遍適用性，可用于組織工程中多種種子細(xì)胞的標(biāo)記。

綜上所述，本實驗通過研究影響EGFP逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)系統(tǒng)轉(zhuǎn)染活細(xì)胞效率的主要相關(guān)參數(shù)，建立了一種穩(wěn)定高效的活細(xì)胞EGFP標(biāo)記技術(shù)，以該技術(shù)標(biāo)記成體干細(xì)胞和成熟分化細(xì)胞均取得較高轉(zhuǎn)染率，而且轉(zhuǎn)染后細(xì)胞基本保持了原有細(xì)胞的生長代謝及生物學(xué)特性。因此，該技術(shù)的建立可為研究組織工程種子細(xì)胞的體內(nèi)外轉(zhuǎn)歸及細(xì)胞間相互作用提供穩(wěn)定、直觀的檢測手段。

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The Effectiveness of Labeling Technique of Enhanced Green Fluorescent Protein by Transfection into Living Cell

LU Xiaojie1,ZHOU Guangdong2,MA Lijun3,LIU Xia4,CAO Yilin2,4.1 General Hospital of Second Artillery,Beijing 100088, China;2 Shanghai Ninth People′s Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China;3 Renji Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200001,China;4 Plastic Surgery Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences,Beijing 100144,China.Corresponding author:ZHOU Guangdong (E-mail: guangdongzhou@126.com).

Objective To explore the vital parameters which affect transfection efficiency of Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP)retrovirus expression system in living cells and to establish a stable and effective labeling technique of living cells.Methods PG13 cells with EGFP retrovirus vector were expanded in vitro and the supernatant was respectively collected at 12 h,24 h,36 h,48 h for the retrovirus transfection of BMSCs.The transfection efficiencies of retrovirus in BMSCs were detected by flow cytometer and fluorescent microscope to confirm the optimal collection time of the retrovirus supernatant.BMSCs were transfected twice by the optimal supernatant and then were selected by low-dose puromycin for 6 h. Transfection efficiency and cell vitality were detected to evaluate the effect of transfection.ADSCs and FBs were transfected with optimal condition to explore the feasibility of labeling technique in other stem cells or differentiated cells.Results According to the results of flow cytometer and fluorescent microscope,the retrovirus supernatant collected at 24 h reached the highest transfection efficiency of(64.56±2.53)%.The high transfection efficiency was also reached(56.98±3.22)%at 36 h while relatively low at 12 h and 48 h,(47.39±1.82)%and (37.84±1.77)%.After transfected twice and selected,over 80% BMSCs expressed EGFP with fine cell vitality and morphology.Using this transfection methods,ADSCs and FBs weretransfected likewise and both of them reached high transfection efficiencies of over 80%．Conclusion This study established a stable and effective cell abeling technique of EGFP,which can be widely used for the related research of cell tracing and cell interaction in tissue engineering．

Enhanced Green Fluorescent Protein;Retrovirus;Cell labeling;Tissue engineering

Q813.1+2

A

1673－0364（2011）04－0181－05

2011年7月19日；

2011年8月14日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2011.05.001

國家自然科學(xué)基金（30300353）。

100088 北京市 中國人民解放軍第二炮兵總醫(yī)院（呂曉杰）；200011 上海市 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院整復(fù)外科（周廣東，曹誼林）；200001 上海市 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院 （馬俐君）；100044 北京市 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院整形外科醫(yī)院（曹誼林、劉霞）。

通迅作者：周廣東（E-mail：guangdongzhou@126.com）。