王 雪 王丹茹

聚酰胺-胺型樹狀聚合物介導基因轉(zhuǎn)染的實驗研究

王 雪 王丹茹

目的 探討聚酰胺-胺型樹狀聚合物（PAMAM）作為基因載體，體外轉(zhuǎn)染成纖維細胞的可行性。方法 ① 將pEGFP與PAMAM按不同電荷比混合，通過原子力顯微鏡（AFM）對PAMAM和PAMAM-pEGFP復合物進行粒徑、形態(tài)的表征；凝膠電泳實驗和Zeta電位實驗檢驗PAMAM與pEGFP質(zhì)粒在不同電荷比時形成復合物的能力；通過DNA共沉淀試驗檢測不同電荷比下PAMAM對質(zhì)粒pEGFP的包封率。②將不同電荷比的PAMAM-pEGFP復合物轉(zhuǎn)染至小鼠胚胎成纖維細胞系，48 h后熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染情況。③CCK-8實驗檢測轉(zhuǎn)染后細胞的增殖活性。結(jié)果 PAMAM-pDNA復合物的粒徑約10 nm。PAMAM在電荷比大于2時就能有效包裹質(zhì)粒。隨電荷比的增加，復合物的Zeta電位增加，在溶液中的穩(wěn)定性和分散性也提高。包封率在電荷比為4∶1時達95%。轉(zhuǎn)染效率隨電荷比的增加呈增高趨勢，其中在4∶1和6∶1時轉(zhuǎn)染效率達到最高。細胞毒性與電荷比有關，電荷比大于6∶1時，PAMAM對細胞生長有毒性作用。結(jié)論 PAMAM納米載體可安全有效地介導基因轉(zhuǎn)染，是一種理想的基因遞送系統(tǒng)。

聚酰胺-胺型樹狀聚合物 成纖維細胞 轉(zhuǎn)染 基因治療

聚酰胺-胺（Polyamidoamine，PAMAM）樹枝狀聚合物是一種高度分枝、表面多價、呈放射狀球體結(jié)構(gòu)的新型納米級高分子聚合物。屬于非生物材料，無免疫原性和遺傳毒性。其表面具有大量帶正電的末端功能基團，在生理條件下，可以與帶負電的DNA通過靜電作用形成納米級復合物。通過非特異性內(nèi)吞作用進入細胞。在溶酶體中，其表面大量的堿性端基發(fā)揮“質(zhì)子海綿效應”，緩沖強酸性環(huán)境的降解作用，而將遺傳物質(zhì)釋放到胞漿中，進而移入胞核完成轉(zhuǎn)染過程[1－2]。

就理論而言，所有器官都可以是基因治療的靶器官，皮膚作為人體最大的器官，在基因治療中具有獨特優(yōu)勢：容易獲取、選擇范圍及部位充足；能夠監(jiān)控基因表達，若出現(xiàn)不良反應可以及時中止；皮膚血供豐富，基礎代謝旺盛，可作為全身系統(tǒng)性疾病基因治療的靶器官。皮膚中含量最為豐富的細胞就是成纖維細胞。因此，本實驗中，我們使用小鼠胚胎成纖維細胞系 （3T3細胞），用綠色熒光蛋白基因EGFP模擬治療性基因，探索以納米材料PAMAM為基因遞送載體、以皮膚為靶器官的基因治療方法治療皮膚及瘢痕性疾病[3]。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗在上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院組織工程實驗室完成。3T3細胞為本實驗室提供。真核表達質(zhì)粒pEGFP（美國GeneCopoeia公司），大量質(zhì)粒抽提純化試劑盒（上海天根試劑公司），PAMAM G5(美國Sigma公司)，DMEM高糖培養(yǎng)液(美國Gibco公司)，胎牛血清FBS（美國BD公司），HEPES緩沖液(美國Invitrogen公司)，CCK-8(日本Dojindo公司)。

1.2 方法

1.2.1 PAMAM-pEGFP復合物的制備

取1 mL PAMAM G5甲醇溶液，以真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將甲醇抽吸掉，加入10 mM HEPES,10%（w/v）蔗糖緩沖液（pH 7．4）溶解，配制成不同濃度。將抽提純化后經(jīng)電泳實驗鑒定的質(zhì)粒pEGFP（0．25 mg/mL）與PAMAM等體積混合，室溫下孵育30 min，獲得PAMAM/pEGFP電荷比為1∶1～8∶1的復合物。

1.2.2 PAMAM及PAMAM-pEGFP復合物粒徑和形態(tài)的表征

將5%（w/v）PAMAM甲醇溶液稀釋100倍，將電荷比為4∶1的PAMAM/pEGFP復合物溶液稀釋至pEGFP濃度為5 μg/mL，分別取2 μL滴到云母片上，室溫下自然風干后，用原子力顯微鏡檢測兩者的粒徑和形態(tài)。

1.2.3 瓊脂糖凝膠阻滯實驗

在20 μL的反應體系中，將不同濃度的PAMAM與pEGFP各8 μL混合配成電荷比1∶1～8∶1的復合物，其余用PBS緩沖液補足。混勻后，室溫下靜置30 min。配制1%（w/v）的瓊脂糖凝膠，85 mV，電泳30 min?？膳袛郟AMAM/pEGFP復合物的形成情況，以及復合物中pEGFP的狀態(tài)（開環(huán)或是閉環(huán)）。

1.2.4 Zeta電位

配制pEGFP終濃度為8%、電荷比1∶1～8∶1的復合物體系，其余用去離子水補足，用Zeta電位儀檢測Zeta電位，每組重復6次。

1.2.5 PAMAM對pEGFP包封率的表征

電荷比1∶1～8∶1的PAMAM-pEGFP復合物32 μL（含4 μg質(zhì)粒，濃度0．125 μg/μL）用去離子水將DNA濃度稀釋30倍。12 000 r/min低溫高速離心15 min后,通過DU-800核酸分析儀測上清質(zhì)粒DNA 260 nm的吸光度。經(jīng)過高速離心，與PAMAM結(jié)合形成復合物的pEGFP沉到管底，未被結(jié)合的pEGFP則留在上清液中。通過測其濃度可計算未被結(jié)合的pEGFP的量，從而可算出被包封的pEGFP的量。

1.2.6 細胞培養(yǎng)與基因轉(zhuǎn)染

3T3細胞用含10%FCS的高糖DMEM培養(yǎng)液，37℃、5%CO2下培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前18 h，按2×104個/孔的密度接種到24孔板，實驗分5個實驗組，即1∶1、2∶1、4∶1、6∶1和8∶1，以及1個空白對照組，每組設三個副孔。待細胞生長至60%～80%融合時，每孔加入200 μL轉(zhuǎn)染試劑，輕搖后轉(zhuǎn)入培養(yǎng)箱培養(yǎng)，5 h后，將轉(zhuǎn)染試劑吸去，每孔加入500 μL普通培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。48 h后在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果，隨機選取鏡下視野，數(shù)200個細胞，計算其中發(fā)熒光的細胞數(shù)目，每組重復取3個視野，以此計算轉(zhuǎn)染效率。

1.2.7 細胞毒性檢測

按每孔2 000個細胞接種到96孔板中，24 h后，分別加入不同電荷比的轉(zhuǎn)染試劑100 μL，空白組加等量普通培養(yǎng)液，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育5 h后，吸去轉(zhuǎn)染試劑，每孔加入 100 μL普通培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。48 h后，每孔加入10 μL CCK-8，37℃、5%CO2中孵育2～3 h，在酶聯(lián)免疫檢測儀OD 490 nm處測量各孔的吸光值，連測3 d。

1.3 統(tǒng)計學處理

應用SPSS 17．0統(tǒng)計學軟件，采用單因素方差分析進行統(tǒng)計學數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果

2.1 PAMAM及PAMAM-pEGFP復合物粒徑和形態(tài)的表征

原子力顯微鏡對PAMAM及PAMAM-pEGFP復合物粒徑、形態(tài)的表征，鏡下可見PAMAM顆粒小，分散性好，粒徑大小約10 nm（圖1A）。PAMAM-pEGFP復合物分布均勻，粒徑大小約60 nm（圖1B）。

圖1 PAMAM及PAMAM-pEGFP復合物的原子力顯微鏡圖Fig.1AFM image of PAMAM andPAMAM-pEGFP complex

2.2 瓊脂糖凝膠阻滯實驗

該實驗檢測PAMAM結(jié)合DNA的能力。結(jié)果顯示，PAMAM對DNA的包裹壓縮作用隨電荷比的增加而增強。電荷比1∶1時，兩者之間結(jié)合能力較弱，當達2∶1后，便可充分保護DNA不被電泳出加樣孔（圖 2）。

圖2 不同電荷比下的PAMAM結(jié)合DNA的情況Fig.2 The results of PAMAM binding DNA by different charge ratios

2.3 Zeta電位

PAMAM-pEGFP復合物整體帶正電荷。隨著電荷比的增加，Zeta電位值也增加，表明PAMAM-pEGFP復合物表面的凈正電荷量增加，復合物顆粒間斥力也隨之增加，使其分散性得到提高（圖3）。

圖3 不同電荷比下復合物Zeta電位（﹟示與1∶1組相比較，P＜0.05）Fig.3 Zeta potential by different charge ratios (﹟P＜0.05,compared to1:1 group)

2.4 PAMAM包封率的表征

經(jīng)單因素方差分析，各組間差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。隨電荷比的增加，PAMAM對pEGFP的包封率也越高（圖4）。

圖4 不同電荷比下PAMAM的包封率（﹟示與1∶1組相比較，P＜0.05）Fig.4 Envelopment ratio of PAMAM by different charge ratios (﹟P＜0.05,compared to1∶1 group)

2.5 轉(zhuǎn)染效率

轉(zhuǎn)染效率隨電荷比的變化而變化，4∶1、6∶1時轉(zhuǎn)染效率最高，且二者無明顯差異；8∶1時轉(zhuǎn)染效率反而有所下降。跟脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染相比，效率略低。轉(zhuǎn)染后48 h的表達率最高。72 h后綠色熒光蛋白開始降解（圖 5，6）。

圖5 不同電荷比下的轉(zhuǎn)染效率（﹟示與1∶1組相比較，P＜0.05）Fig.5 Transfection efficiency by different charge ratios (﹟P＜0.05,compared to1∶1 group)

圖6 熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率Fig.6 Transfection efficiency of PAMAM and liposome

2.6 細胞毒性試驗

實驗結(jié)果表明，脂質(zhì)體的毒性相對較明顯；組間比較顯示，電荷比越大，毒性越大。電荷比小于4∶1時，對細胞幾乎無影響；但當電荷比大于6∶1時，對細胞生長有毒性作用（圖7）。

圖7 不同電荷比下細胞增殖隨時間的變化情況（﹟示與1∶1組相比較，P＜0.05）Fig.7 Cell proliferation by different charge ratioes at different time(﹟P＜0.05,compared to1∶1 group)

3 討論

選擇恰當?shù)霓D(zhuǎn)染方法將治療基因高效、安全地遞送至細胞核是基因治療最重要的步驟。基因治療開展至今，轉(zhuǎn)染手段始終是限制其臨床推廣的難題。本研究主要探討了新型納米材料作為基因遞送系統(tǒng)體外轉(zhuǎn)染成纖維細胞系的可行性，內(nèi)容包括復合物的制備、表征，轉(zhuǎn)染效率和毒性的檢測[4]。

對PAMAM和PAMAM-pEGFP復合物進行表征的目的，是檢測其粒徑和形態(tài)是否正常，是否能夠有效形成復合物，這一實驗步驟是不可或缺的。因為，PAMAM是一種高度分支化、由分子核心向外放射開來、活性帶電的氨基末端覆蓋分子表面的高分子聚合物，在溶液中很容易受到各種物理化學因素的影響，而導致其表面電性電量及形態(tài)大小的改變，影響其與DNA通過靜電作用形成復合物，從而影響轉(zhuǎn)染的效果。原子力顯微鏡可在常溫干燥狀態(tài)下表征PAMAM及其復合物的表面形態(tài)、粒徑大小和分布情況，鏡下可見到PAMAM及PAMAM-pEGFP復合物粒徑都在納米級以下，呈球形，分布均勻。但也可見到團聚的現(xiàn)象，這主要是離子濃度、pH值影響了溶液中的電荷分布，破壞了納米顆粒之間的平衡。Vlasov等[5]在透射電鏡下觀察到了納米顆粒團聚，并認為這是造成轉(zhuǎn)染效率低的最主要原因。Yoza等[6]通過表征前超聲復合物的辦法分散團聚的納米顆粒。本實驗中參考并采用了此法。

瓊脂糖凝膠滯留實驗的原理，就是未被PAMAM充分吸附的DNA會在電泳過程中遷移，而形成紫外光下的可見條帶，而被充分吸附的DNA就會以PAMAM-pEGFP復合物的形式滯留在加樣孔，可據(jù)此判斷兩者的復合情況。實驗證明，當電荷比大于2∶1時，PAMAM就能充分地吸附壓縮DNA，可見PAMAM結(jié)合DNA的能力是很強的。Zeta電位是表征膠體分散系穩(wěn)定性的重要指標，是對顆粒之間相互排斥或吸引力強度的度量。Zeta電位越高，體系越穩(wěn)定，即溶解或分散可以抵抗聚集，一般認為達到25 mV后體系就很穩(wěn)定。實驗發(fā)現(xiàn)，Zeta電位也隨電荷比的增加而增加，表明復合物表面的凈正電荷量在增加，可以提供更多的活性氨基與細胞膜靜電吸附。當電荷比達到4∶1時，Zeta電位就超過25 mV，可見復合物在溶液中分散性良好，整個體系處于穩(wěn)定狀態(tài)。但是，Zeta過高（一般認為大于50 mV）就會對細胞膜造成損傷。

不論基因載體還是藥物載體，包封率都是評價其裝載容量和能力的重要指標。本實驗中運用高速離心法，通過計算離心前后上清液中pEGFP的質(zhì)量變化，來評價PAMAM的包封能力。本實驗顯示，各組包封率普遍大于80%，而且隨電荷比的增加呈增高的趨勢，4∶1時包封率達到95%，進一步證明了前面提到的PAMAM有較強pDNA結(jié)合能力的結(jié)論。

相對于目前廣泛使用的商品化轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體來說，PAMAM的轉(zhuǎn)染效率并不理想。有報道認為，基因在轉(zhuǎn)染過程中會遇到層層障礙，包括跨膜過程、被溶酶體包吞后降解、不能有效釋放DNA、釋放后DNA滯留在胞漿、DNA在入核前被降解以及DNA入核困難等[7－8]。對此，大量研究進行了諸多方面的優(yōu)化。例如，Nam等[9]在以羥基為末端的PAMAM酯表面連接精氨酸，可以有效緩沖溶酶體內(nèi)的酸堿度變化，有利于DNA由溶酶體釋放入胞漿，進而入核參與核內(nèi)反應。Ma等[10]用去炎舒松修飾PAMAM以開大核孔，易化復合物入核過程，顯著提高了轉(zhuǎn)染效率。另外，在轉(zhuǎn)染過程中添加氯喹，氯喹在內(nèi)涵體中積累可提高微環(huán)境的pH值，誘導內(nèi)涵體滲透性膨脹而最終崩解，有利于將DNA釋放到胞漿中[11]。在本室驗中，我們使用加熱的方法降解PAMAM自身，將其本身嚴格規(guī)整的結(jié)構(gòu)分散開來，增加了轉(zhuǎn)染的靈活性，使之與DNA的結(jié)合更緊密，在釋放DNA時更易于膨脹，轉(zhuǎn)染效率明顯提高。結(jié)合本實驗的結(jié)果來看，PAMAM介導的轉(zhuǎn)染效率還有待于進一步的優(yōu)化。

PAMAM對細胞的毒性具有復合物濃度和電荷比依賴性，并且與細胞類型有關。引起細胞毒性甚至凋亡的兩種途徑為：①復合物吸附到細胞表面時，其表面氨基可在細胞磷脂雙分子上形成1個納米微孔，胞漿從這些微孔流出而造成細胞死亡；②復合物被溶酶體融合后，氨基質(zhì)子化，造成溶酶體堿化，質(zhì)子海綿效應使得溶酶體崩解，從而將大量的水解酶釋放到胞漿中，使線粒體膜電位變化，外膜通透性增加導致凋亡[12]。這是所有陽離子聚合物引起細胞毒性的共同特點。但是與脂質(zhì)體相比，PAMAM的毒性要小得多，而且在電荷比小于4∶1時，對細胞活性幾乎無影響。大于6∶1時，細胞生長受到一定程度的抑制。

本實驗結(jié)果表明，G5 PAMAM可以有效介導體外非特異性基因轉(zhuǎn)染真核細胞。表明豐富的正性氨基與負性的核酸形成粒徑小、穩(wěn)定、高分散、低毒性的納米顆粒，可以將目的基因遞送至真核生物成纖維細胞。相信經(jīng)過進一步優(yōu)化，PAMAM可以作為一種以皮膚為靶器官的基因治療的新型載體。

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Experimental Study of Gene Transfer Mediated by Polyamidoamine Dendrimers

Wang Xue,Wang Danru.

Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Shanghai Ninth People′s Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 20011,China.Corresponding author:WANG Danru(E-mail:wangdanru@126.com).

Objective To explore the feasibility of PAMAM as a gene carrier transfecting into fibroblasts.Methods The p-EGFP was mixed with PAMAM by different charge ratios.① The size and shape of PAMAM and PAMAM-pEGFP complex were characterized by Atomic force microscopy(AFM).The ability of PAMAM forming complex was analysed by gel electrophoresis assay and Zeta potential measurememt.The encapsulating efficiency was measured by co-sedimentation assay.② The PAMAM-pEGFP complexes were delivered to mouse embryonic skin fibroblasts cell line (3T3),and the transfection efficiency was observed after 48h by fluorescence microscope.③The post-transfected cell viability was determined by CCK-8 test.Results The diameter of PAMAM-pDNA complex was 10 nm approximately.By a charge ratio of 2∶1 or above, PAMAM can condense p-EGFP effectively.With the increase of charge ratio,the Zeta potential of the complex increased,the stability and dispersion of the complex in aqueous solution were also improved.By a charge ratio of 4∶1,the envelopment rate can reach 95%.With the increase of charge ratio,the transfection efficiency increased,especially by a charge ratio of 4∶1 or 6∶1.The toxicity of the nanoparticles was dependent on charge ratio.When the charge ratio was over 4∶1,the cell viability would be inhibited in certain extent.Conclusion PAMAM could transfect effectively and safely and becomes a promising gene delivery system.

PAMAM Dendrimer;Fibroblast;Transfection; Gene therapy

Q813.1+2

A

1673－0364（2011）04－0181－05

2011年7月23日；

2011年8月10日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2011.05.001

200011 上海市 上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院 整復外科。

王丹茹（E-mail：wangdanru@126.com）。