房超，李葉云，常欣，丁菲，江昌俊

（安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶葉生物化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽合肥230036）

茶樹(shù)脫水素基因dhn2原核表達(dá)條件優(yōu)化

房超，李葉云，常欣，丁菲，江昌俊*

（安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶葉生物化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽合肥230036）

為了提高可溶性脫水素dhn2重組蛋白在大腸桿菌的表達(dá)量，研究了不同誘導(dǎo)條件對(duì)其表達(dá)的影響，包括誘導(dǎo)時(shí)間，誘導(dǎo)溫度，IPTG濃度和初始誘導(dǎo)濃度。結(jié)果表明：重組表達(dá)載體pEASY-E1-dhn2在大腸桿菌中最佳誘導(dǎo)時(shí)間為4h，最佳誘導(dǎo)溫度為30℃，最佳IPTG誘導(dǎo)濃度為0.8mmol/L，最佳誘導(dǎo)初始濃度為OD600=0.2。

茶樹(shù)；脫水素；條件優(yōu)化

脫水素最早發(fā)現(xiàn)于20世紀(jì)80年代，屬于LEAD-Ⅱ家族，分子量從9到200kD不等[1]。脫水素富含甘氨酸和賴氨酸，具有很高的親水性，能與膜脂結(jié)合阻止水分過(guò)多流失，以保護(hù)細(xì)胞免受干旱損傷[2-4]。另外，脫水素還具有蛋白保護(hù)能力，其K片段的雙親水α-螺旋結(jié)構(gòu)可以穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，起到了類似于分子伴侶的作用[5]。柑橘[6]、桃樹(shù)[7]和菠菜[8]等植物中發(fā)現(xiàn)脫水素能在低溫下維持乳酸脫氫酶的活性。而茶樹(shù)體內(nèi)的脫水素蛋白的功能研究少見(jiàn)報(bào)道。

1 材料和方法

1.1.2 試劑胰蛋白胨，酵母浸出粉，氯霉素，氨芐青霉素購(gòu)自索萊寶公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷購(gòu)自上海生工；分子質(zhì)量蛋白Marker購(gòu)自北京天根公司。

1.2.1 誘導(dǎo)時(shí)間優(yōu)化

預(yù)培養(yǎng)菌液至OD600=0.5時(shí)，分裝5mL菌液至滅菌的試管中，加入終濃度為0.1mmol/L的IPTG，37℃繼續(xù)培養(yǎng)。在0h，2h，3h，4h，6h，8h時(shí)分別取菌液離心收集菌體，用bindingbuffer（50mmol/LPBSBuffer pH7.9，300mmol/LNacl，10mmol/L咪唑）懸浮菌體。冰水浴超聲破碎（功率300W，破碎1s，間隙5s，每次循環(huán)數(shù)50，共5次）后，于4℃，8000r/min離心20min，保存上清。280nm下檢測(cè)上清中蛋白總量，取含等量蛋白質(zhì)的上清處理，參照分子克隆實(shí)驗(yàn)指南[9]方法進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)目的蛋白表達(dá)情況。

1.2.2 誘導(dǎo)溫度優(yōu)化

預(yù)培養(yǎng)菌液至OD600=0.5時(shí)，取5mL菌液至滅菌的試管中，加入終濃度為0.1mmol/L的IPTG后，分別轉(zhuǎn)入16℃，25℃，30℃，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4h后，按1.2.1方法處理菌液，進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)目的蛋白表達(dá)情況。

1.2.3 IPTG濃度優(yōu)化

預(yù)培養(yǎng)菌液至OD600=0.5時(shí)，取5mL菌液至滅菌的試管中，分別向各試管中加入終濃度為0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.5mmol/L、0.8mmol/L、1mmol /L、2mmol/L的IPTG，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4h后，按1.2.1方法處理菌液，進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)目的蛋白表達(dá)情況。

1.2.4 初始菌液濃度優(yōu)化

預(yù)培養(yǎng)菌液至OD600分別為0.2，0.3，0.5，0.9，1.0時(shí)取5mL菌液分裝至試管中，加入終濃度為0.1mmol/L的IPTG，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4h后，按1.2.1方法處理菌液，進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)目的蛋白表達(dá)情況。

2 結(jié)果與分析

圖1 不同誘導(dǎo)時(shí)間誘導(dǎo)的SDS-PAGE分析1：蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；2：誘導(dǎo)前；3：2h；4：3h；5：4h；6：6h；7：8h

圖2 不同誘導(dǎo)時(shí)間的生物量分析

SDS-PAGE檢測(cè)發(fā)現(xiàn)隨著誘導(dǎo)時(shí)間增加，重組蛋白的表達(dá)量不斷升高，至4h達(dá)到最大，占上清中總蛋白的40.4%，之后表達(dá)量開(kāi)始減少(圖1,2)。為了使重組蛋白高效表達(dá)，選擇4h為最佳的誘導(dǎo)時(shí)間。

SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果如圖3，隨著誘導(dǎo)溫度升高，可溶性蛋白含量增加，30℃時(shí)上清中的目的蛋白含量最高，占總蛋白的54.3%（圖4），之后融合蛋白含量開(kāi)始下降。所以選用30℃作為最佳誘導(dǎo)溫度。

通過(guò)SDS-PAGE檢測(cè)（圖5），菌液的IPTG濃度值在0.1～0.8mmol/L時(shí)，誘導(dǎo)蛋白產(chǎn)量逐漸增大，0.8mmol/L時(shí)產(chǎn)量最大，占總蛋白的28%(圖6)，之后開(kāi)始下降。確定0.8mmol/L為IPTG濃度的最適值。

圖3 不同溫度誘導(dǎo)的SDS-PAGE分析1：蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；2：誘導(dǎo)前；3：25℃；4：16℃；5：30℃；6：37℃

圖4 不同溫度誘導(dǎo)的生物量分析

圖5 不同IPTG濃度誘導(dǎo)的SDS-PAGE分析1：蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；2：誘導(dǎo)前；3：0.1mmol/L；4：0.2mmol/L；5：0.5mmol/L；6：0.8mmol/L；7：1.0mmol/L；8：2.0mmol/L

圖6 不同IPTG濃度誘導(dǎo)的生物量分析

圖7 不同初始菌液濃度誘導(dǎo)的SDS-PAGE分析1：蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；2：誘導(dǎo)前；3：OD600=0.2；4：OD600=0.3；5：OD600=0.5；6：OD600=0.9；7：OD600=1

圖8 不同初始菌液OD的生物量分析

如圖7所示，菌液OD600=0.2時(shí)，可溶蛋白含量最高，占總蛋白的25.6%，隨后菌液上清中的可溶蛋白量隨著初始誘導(dǎo)濃度的增加而減少，到OD600=1.0時(shí)，可溶性蛋白只占總蛋白的12.9%（圖8）。

3 討論

本文研究結(jié)果表明誘導(dǎo)溫度、時(shí)間、IPTG濃度和初始菌液濃度對(duì)可溶性脫水素dhn2重組蛋白的表達(dá)量影響很大，其中以誘導(dǎo)溫度最為明顯?？扇苄悦撍厝诤系鞍椎暮繉?duì)之后的蛋白純化影響很大。大量的可溶性蛋白可減少鎳離子親和層析時(shí)的非特異性吸附，因而蛋白純化的效果顯著提高。所以本文選用可溶性蛋白的含量百分?jǐn)?shù)作為選擇原核表達(dá)條件的主要參考標(biāo)準(zhǔn)。經(jīng)過(guò)SDS-PAGE電泳和QuantityOne軟件分析，發(fā)現(xiàn)表達(dá)工程菌中的可溶性脫水素蛋白含量在4h表達(dá)量最大，隨后逐漸降低?？赡苁请S著時(shí)間的延長(zhǎng)，培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)逐漸減少，不能滿足細(xì)菌的生長(zhǎng)需求。誘導(dǎo)溫度對(duì)可溶性融合蛋白的含量影響非常大，低溫下菌體生長(zhǎng)緩慢，表達(dá)的重組蛋白量降低。但溫度過(guò)高，蛋白質(zhì)可能會(huì)因非正常折疊而形成包涵體，致使可溶性蛋白含量相應(yīng)減少。低濃度的IPTG對(duì)誘導(dǎo)效果影響不大，高濃度的IPTG對(duì)細(xì)胞的毒性作用使細(xì)菌生長(zhǎng)緩慢。初始菌液濃度和可溶性脫水素蛋白含量百分比成反比，所以對(duì)高濃度的菌液進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)不利于可溶性蛋白的收集。

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Q344+.13

A

1006-5768(2011)04-0153-03

2011-05-23

房超(1985-)，男，碩士，研究方向?yàn)椴铇?shù)生物技術(shù)及種質(zhì)資源。

江昌?。?957-），男，教授，E-mail:jiangcj@ahau.edu.cn

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.30871568)和安徽省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（NO.090411014）。