許智華 劉海霞

（山西省兒童醫(yī)院耳鼻喉科，山西太原 030013）

COCH基因是人類(lèi)發(fā)現(xiàn)的第1個(gè)伴前庭功能障礙的常染色體顯性遺傳非綜合征型耳聾基因，定位于14號(hào)染色體長(zhǎng)臂14q12～13，在耳蝸和前庭組織中有高度表達(dá)，其編碼的Cochlin蛋白是內(nèi)耳細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分。

COCH基因突變可致患者出現(xiàn)漸進(jìn)性感音神經(jīng)性耳聾、前庭功能障礙癥狀，診斷為人類(lèi)常染色體顯性遺傳非綜合征性耳聾疾病（Non-syndrom ic autosomal dom inant sensofineural deafness，DFNA）DFNA9[1]。

M icroRNAs（m iRNAs）是一種小的內(nèi)源性非編碼RNA分子，大約由21～25個(gè)核苷酸組成。這些小的m iRNA通常靶向一個(gè)或者多個(gè)mRNA，通過(guò)翻譯水平的抑制或斷裂靶標(biāo)mRNAs而調(diào)節(jié)基因的表達(dá)[2]。

謝菲爾德大學(xué)沃爾特·馬科蒂博士等通過(guò)對(duì)小白鼠的研究發(fā)現(xiàn)，m iR-96與哺乳動(dòng)物耳蝸發(fā)育密切相關(guān)，m iR-96突變會(huì)導(dǎo)致人和小鼠漸進(jìn)性失聰。研究人員認(rèn)為，m iR-96會(huì)調(diào)節(jié)耳蝸毛細(xì)胞生理發(fā)育進(jìn)程，也會(huì)影響耳蝸毛細(xì)胞的形態(tài)，對(duì)哺乳動(dòng)物的聽(tīng)覺(jué)系統(tǒng)至關(guān)重要[3-5]。根據(jù)目前的研究基礎(chǔ)，筆者通過(guò)熒光定量PCR來(lái)檢測(cè)m iR-96是否會(huì)調(diào)節(jié)COCH基因的表達(dá)情況，或者兩者之間存在某種關(guān)聯(lián)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

B95-8 （絨猴EBV 轉(zhuǎn)化的白細(xì)胞）購(gòu)自上海中科院細(xì)胞庫(kù)；RPM I1640培養(yǎng)基與胎牛血清（FBS）為PAA產(chǎn)品；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectam ineTM 2000為Invitrogen公司產(chǎn)品；一步法RT-PCR擴(kuò)增試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司；m iRNA m im ics和m iRNA inhibitor購(gòu)自廣州銳博公司。

1.2 永生細(xì)胞系的建立

參照趙蘇瑛等[6]的凍存白細(xì)胞法進(jìn)行建系。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

轉(zhuǎn)染前1天接種細(xì)胞于24孔板，第2天細(xì)胞匯合度達(dá)到75%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，分組情況如下：m iR-96過(guò)表達(dá)組（加入m iRNA m im ics）、正常對(duì)照組、m iR-96低表達(dá)組（加入m iRNA inhibitor），每組重復(fù)3次，操作步驟按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，試劑用量按說(shuō)明書(shū)的推薦用量而加。

1.4 染料法定量檢測(cè)COCH基因的表達(dá)情況

轉(zhuǎn)染24h后，收集細(xì)胞提取RNA，染料法定量檢測(cè)COCH基因的表達(dá)情況。COCH基因引物如下：

F：5'-CTTCACGGTAGATGCTGGAGTAAG-3'；

R：5'-GCCACAATGCCTGCTTCCTC-3'，擴(kuò)增長(zhǎng)度為102bp。

內(nèi)參為GAPDH：F：5'-TCTCTGCTCCTCCTGTTC-3'；R：5'-ACTCCGACCTTCACCTTC-3'，擴(kuò)增長(zhǎng)度為97bp。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS12.0軟件進(jìn)行非參數(shù)一致性檢驗(yàn)、秩和檢驗(yàn)及χ2檢驗(yàn)，P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

圖1 COCH的表達(dá)與m iR-96的關(guān)系

將m iRNA inhibitor組中COCH的相對(duì)表達(dá)水平的平均值設(shè)為1，與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)入m iRNA抑制劑組的COCH的表達(dá)顯著降低（P ＜0.05）；轉(zhuǎn)入m iRNA模擬物組的COCH表達(dá)顯著增高（P ＜ 0.05）。這與通常的m iRNA呈負(fù)調(diào)控的機(jī)理相反，而表現(xiàn)出協(xié)同關(guān)系。見(jiàn)圖1。

3 討論

COCH基因是人類(lèi)發(fā)現(xiàn)的第1個(gè)伴前庭功能障礙的常染色體顯性遺傳非綜合征性耳聾基因，在耳蝸和前庭組織中有高度表達(dá)，其編碼的Cochlin蛋白是內(nèi)耳細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分。COCH基因突變可致患者出現(xiàn)漸進(jìn)性感音神經(jīng)性耳聾、前庭功能障礙癥狀，診斷為DFNA9。DFNA9家系表現(xiàn)為遲發(fā)性、進(jìn)行性聽(tīng)力下降，在不同的家系中耳聾的發(fā)生年齡從十幾歲至四五十歲不等，患者在耳聾發(fā)生時(shí)即伴有走路不穩(wěn)（尤其是在夜間）和頭部運(yùn)動(dòng)時(shí)出現(xiàn)幻視等前庭功能障礙表現(xiàn)，耳聾的外顯率幾乎為100%?？傊?，COCH基因作為一個(gè)在前庭、耳蝸均有表達(dá)的基因，對(duì)于耳蝸及前庭功能變化起著至關(guān)重要的作用，但COCH基因及其編碼的Cochlin蛋白的功能、致病機(jī)制尚不完全清楚[7]。

而最近的研究發(fā)現(xiàn)，m iR-96與哺乳動(dòng)物耳蝸發(fā)育密切相關(guān)，m iR-96突變會(huì)導(dǎo)致人和小鼠漸進(jìn)性失聰。研究表明，通常m iR-96會(huì)在特定階段影響許多與發(fā)育相關(guān)的不同基因表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)毛細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程。一旦小鼠體內(nèi)m iR-96基因中某一區(qū)域的單個(gè)堿基對(duì)突變，就會(huì)導(dǎo)致小鼠眾多的基因表達(dá)的改變。研究論文指出，m iR-96發(fā)生突變，使得小鼠在出生后，其內(nèi)耳和外耳毛細(xì)胞出現(xiàn)生物物理變異之前，感覺(jué)毛細(xì)胞的生理發(fā)育即已受到影響。

此外，m iR-96突變后，毛細(xì)胞靜纖毛束的發(fā)育和耳蝸內(nèi)聽(tīng)覺(jué)神經(jīng)聯(lián)系的構(gòu)建都會(huì)受到影響，這不僅會(huì)影響毛細(xì)胞的敏銳程度，還會(huì)影響感覺(jué)神經(jīng)的電信號(hào)傳遞。據(jù)此，研究人員認(rèn)為，m iR-96會(huì)調(diào)節(jié)耳蝸毛細(xì)胞生理發(fā)育進(jìn)程，也會(huì)影響耳蝸毛細(xì)胞的形態(tài)，對(duì)哺乳動(dòng)物的聽(tīng)覺(jué)系統(tǒng)至關(guān)重要[8-10]。

基于COCH基因和m iR-96發(fā)生突變后均會(huì)引起相似的病癥，筆者試圖探討這兩者之間是否存在某種關(guān)聯(lián)。而本實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)說(shuō)明m iR-96并沒(méi)有對(duì)COCH基因進(jìn)行負(fù)調(diào)控，而是出現(xiàn)協(xié)同現(xiàn)象。這有可能是m iR-96通過(guò)調(diào)控其他相關(guān)因子而促進(jìn)了COCH基因的表達(dá)，從而在動(dòng)物耳蝸發(fā)育中表現(xiàn)出協(xié)同作用?，F(xiàn)有資料表明很多人包括一些新生兒和小孩會(huì)受到漸進(jìn)性失聰?shù)挠绊懀茖W(xué)家對(duì)于漸進(jìn)性失聰?shù)倪z傳因素了解甚少。隨著人們對(duì)COCH基因及其編碼的Cochlin蛋白功能的深入研究，COCH基因及其編碼的Cochlin蛋白功能與DFNA9疾病的相互關(guān)系將得到進(jìn)一步闡明。而同時(shí)，m iR-96發(fā)生變異可導(dǎo)致漸進(jìn)性失聰?shù)姆肿訖C(jī)制的發(fā)現(xiàn)，可為未來(lái)該疾病的治療提供新的分子標(biāo)靶，為改善聽(tīng)力損失和失聰?shù)闹委熓侄蔚於嘶A(chǔ)。

[1]陳金霞，張桂茹，張明輝.COCH 基因與DFNA9的相關(guān)性研究[J].吉林醫(yī)學(xué)，2007，28（2）：169-171.

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[6]趙蘇瑛，張海軍，徐春宏，等. 非綜合征耳聾大家系永生細(xì)胞系的建立及幾種EB病毒轉(zhuǎn)化外周血淋巴細(xì)胞建系方法的探討[J].遺傳，2005，27（3）：447-450.

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