蔡偉明 彭仕駿 呂文強(qiáng) 張志峰

（廣東省揭陽(yáng)市人民醫(yī)院心胸外科，廣東揭陽(yáng) 522000）

食道癌是世界上最常見(jiàn)的6大惡性腫瘤之一，在我國(guó)每年約有25萬(wàn)新患者產(chǎn)生，其死亡率居惡性腫瘤的第4位。至今，已較成功的在分子水平上確認(rèn)食道癌的致病基因，但如何對(duì)其進(jìn)行基因治療仍是一大難題[1-2]。Survivin在人類(lèi)各種腫瘤組織癌細(xì)胞中含量很豐富，但在正常細(xì)胞中卻幾乎不存在[3-4]。Survivin是一個(gè)142個(gè)氨基酸的蛋白，屬于一類(lèi)防止細(xì)胞凋亡的蛋白質(zhì)。

microRNAs（miRNAs）是一個(gè)長(zhǎng)度為21～25個(gè)核苷酸非編碼的小RNA家族，人類(lèi)基因組編碼了超過(guò)1000個(gè)miRNA，通過(guò)干擾mRNA的翻譯而下調(diào)靶基因的表達(dá)。生物信息學(xué)數(shù)據(jù)表明，miRNA幾乎參與體內(nèi)所有的基本的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，包括許多重要腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)。研究表明，miRNA表達(dá)失調(diào)與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)，并已成功利用miRNA對(duì)腫瘤進(jìn)行診斷、分期與生物治療。在現(xiàn)有的基礎(chǔ)上，通過(guò)對(duì)Survivin基因潛在的miRNA進(jìn)行預(yù)測(cè)，挑取評(píng)分較高的miR-542-3p進(jìn)行研究[5-8]。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

人食道癌細(xì)胞株KYSE-510由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院上海生命科學(xué)院贈(zèng)送。細(xì)胞培養(yǎng)用RPMI1640培養(yǎng)基與胎牛血清（FBS）為PAA產(chǎn)品；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000為Invitrogen公司產(chǎn)品；一步法RT-PCR擴(kuò)增試劑盒和染料法定量試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司；miRNA mimics購(gòu)自廣州銳博公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞置于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中，于含10%胎牛血清、100U/m L青霉素、100mg/L鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)。待貼壁生長(zhǎng)后，用含0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA的消化液消化，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

轉(zhuǎn)染前1天接種細(xì)胞于24孔板，第2天細(xì)胞匯合度達(dá)到75%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，分為miR-542-3p過(guò)表達(dá)組（加入miRNA mimics）、正常對(duì)照組，每組重復(fù)3次，操作步驟按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，試劑用量按說(shuō)明書(shū)的推薦用量而加。

1.4 染料法定量檢測(cè)Survivin基因的表達(dá)情況

轉(zhuǎn)染24h后，收集細(xì)胞提取RNA，染料法定量檢測(cè)Survivin基因的表達(dá)情況[9]，引物如下：F：5’-GGTTGTGAATGAGGCTTCTG-3’；R：5’-TGGCTTGCTGGTCTCTTC-3’，擴(kuò)增長(zhǎng)度為125bp。

內(nèi)參為GAPDH：F：5’-TCTCTGCTCCTCCTGTTC-3’；R：5’-ACTCCGACCTTCACCTTC-3’，擴(kuò)增長(zhǎng)度為97bp。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS12.0軟件進(jìn)行非參數(shù)一致性檢驗(yàn)、秩和檢驗(yàn)及x2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 Survivin的表達(dá)與m iR-542-3p的關(guān)系

2 結(jié)果

將miRNA mimics組中Survivin相對(duì)表達(dá)水平的平均值設(shè)為1，與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)入miRNA模擬物組的Survivin的表達(dá)顯著降低（P＜0.01）。顯示miR-542-3p對(duì)Survivin具有明顯的負(fù)調(diào)控作用。見(jiàn)圖1。

3 討論

Survivin是由142個(gè)氨基酸構(gòu)成的蛋白，僅含有單一的BIR功能區(qū)，沒(méi)有環(huán)指結(jié)構(gòu)。Survivin是凋亡抑制蛋白（IAP）家族中的新成員，在人類(lèi)眾多惡性腫瘤中高表達(dá)，具有強(qiáng)烈的凋亡抑制功能和促細(xì)胞增殖活性，并與部分腫瘤的血管生成和預(yù)后有密切關(guān)系，因而已成為基因治療的熱門(mén)靶點(diǎn)。體內(nèi)外研究表明，Survivin可在多種轉(zhuǎn)化細(xì)胞系中表達(dá)，并見(jiàn)于所有人類(lèi)最常見(jiàn)的腫瘤組織，包括肺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、前列腺癌和乳腺癌。

miRNA在不同組織不同發(fā)育階段的持續(xù)保守性表達(dá)具有廣泛的調(diào)控功能。miRNA調(diào)控基因表達(dá)的功能與來(lái)源無(wú)關(guān)，因此miRNA已經(jīng)成為重要的實(shí)驗(yàn)工具。之前的研究表明食道癌細(xì)胞Survivin表達(dá)量會(huì)增多，在這一基礎(chǔ)上，為探討miRNA在腫瘤治療中的應(yīng)用，本研究通過(guò)對(duì)靶向Survivin的miRNA進(jìn)行研究，觀察其對(duì)Survivin的抑制作用。實(shí)驗(yàn)證明miRNA能顯著抑制Survivin基因的表達(dá)，為其在腫瘤基因治療中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。這一研究不僅加深了對(duì)食道癌分子機(jī)制的了解，而且說(shuō)明Survivin可能會(huì)是治療食道癌潛在的靶點(diǎn)[10-13]。

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