馬麗麗 岳 麓 邱文生▲

（1.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院，山東青島 266000；2.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤科，山東青島 266000）

增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）是一種核蛋白，參與DNA的合成和修復(fù)，僅在增殖細(xì)胞中表達(dá)，較高的PCNA增殖指數(shù)（PCNA PI）預(yù)示著較高的腫瘤細(xì)胞增殖活性。一般認(rèn)為PCNA PI越高，腫瘤的增殖能力越活躍，其分化程度越低，惡性程度越高，越容易發(fā)生浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移[1-3]。AgNOR（silver-binding nucleolar organizer regions）是核仁組成區(qū)相關(guān)嗜銀蛋白，AgNOR顆粒數(shù)與細(xì)胞增殖活性、DNA倍體水平有關(guān)[4]。兩者均是反映細(xì)胞增殖活性的主要客觀指標(biāo)。為探討兩者的相互關(guān)系及其與生物學(xué)行為及預(yù)后判斷的關(guān)系，筆者利用PCNA免疫組化研究和AgNOR檢測(cè)，對(duì)比不同分化程度的肝細(xì)胞肝癌（HCC）細(xì)胞的特點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 研究材料

青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科2000～2007年經(jīng)病理確診為肝細(xì)胞肝癌患者的手術(shù)切除標(biāo)本67例。標(biāo)本經(jīng)10%福爾馬林固定，石蠟包埋，連續(xù)切片4μm，HE染色。組織分類按WHO分類標(biāo)準(zhǔn)分級(jí)，高分化19例，中分化36例，低分化12例。按腫塊長(zhǎng)徑分為＜3cm組7例、3～5cm組20例、＞5cm組40例。術(shù)前未經(jīng)放化療治療，術(shù)后隨訪2年以上，其中術(shù)后生存（2年以上）15例，術(shù)后短期死亡（半年以內(nèi)）11例，生存期在半年～2年41例。所有病例標(biāo)本進(jìn)行PCNA免疫組化檢測(cè)和AgNOR檢測(cè)。

1.2 研究方法

PCNA免疫組化檢測(cè)采用LSAB法，PCNA（Pcl0）及LSAB試劑盒為美國(guó)Dako公司產(chǎn)品；免疫組化檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)：陽(yáng)性為細(xì)胞核呈界限清楚的棕褐色反應(yīng)。陽(yáng)性結(jié)果記錄標(biāo)準(zhǔn)：每張切片隨機(jī)觀察高倍視野5個(gè)，每個(gè)視野計(jì)腫瘤細(xì)胞100個(gè)，計(jì)算增殖指數(shù)（PI＝PCNA陽(yáng)性細(xì)胞核數(shù)/計(jì)測(cè)細(xì)胞總數(shù)）。PCNA PI可分為3級(jí)：Ⅰ級(jí)（0～25%），Ⅱ級(jí)（26%～75%），Ⅲ級(jí)（76%～100%）。AgNOR銀染方法：按Ploton改進(jìn)的石蠟切片AgNOR染色方法；銀染陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)：清晰的大小不等的棕黑色銀染AgNOR顆粒位于細(xì)胞核內(nèi)。圖像分析技術(shù)（IAT）測(cè)量AgNOR顆粒數(shù)：切片經(jīng)多功能圖像分析儀（放大倍數(shù)10×40），對(duì)每例切片腫瘤細(xì)胞核內(nèi)陽(yáng)性顆粒進(jìn)行計(jì)數(shù)，每例隨機(jī)檢測(cè)50個(gè)腫瘤細(xì)胞，取其平均值為最后結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 PCNA PI及AgNOR顆粒數(shù)與組織學(xué)分級(jí)的關(guān)系

隨著組織分化程度的降低，PCNA PI逐漸增大，AgNOR顆粒數(shù)逐漸增多。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示：低分化肝癌、中分化肝癌和高分化肝癌之間差異顯著（P＜0.01）。見(jiàn)表1。

表1 PCNA PI及AgNOR顆粒數(shù)與組織學(xué)分級(jí)的關(guān)系（±s）

表1 PCNA PI及AgNOR顆粒數(shù)與組織學(xué)分級(jí)的關(guān)系（±s）

組織學(xué)分級(jí) n PCNA PI（%） AgNOR顆粒數(shù)（個(gè)）高分化 19 10.700±7.123 3.29±1.17中分化 36 36.500±7.874 3.93±0.90低分化 12 61.600±16.382 7.07±1.84

2.2 PCNA PI及AgNOR顆粒數(shù)與腫塊大小的關(guān)系

腫瘤最大徑＜3cm組、3～5cm組、＞5cm組的PCNA PI分別為22.6%、30.9%、37.7%，AgNOR計(jì)數(shù)分別為（2.89±0.41）、（3.70±1.19）、（4.79±2.03）。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示：腫瘤最大徑＜3cm組與腫瘤最大徑＞5cm組之間有顯著差異（P＜0.01）；腫瘤最大徑＜3cm組與腫瘤最大徑3～5cm組、腫瘤最大徑3～5cm組與腫瘤最大徑＞5cm組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。由此可見(jiàn)，PCNA PI及AgNOR顆粒數(shù)與腫塊大小有關(guān)，即腫瘤腫塊越大、其PCNA PI越大，腫瘤腫塊越大、AgNOR顆粒數(shù)越多。

2.3 PCNA PI及AgNOR顆粒數(shù)與預(yù)后的關(guān)系

對(duì)67例患者全部進(jìn)行了術(shù)后隨訪，兩者與預(yù)后的關(guān)系見(jiàn)表2。生存期＞2年患者的PCNA PI明顯小于生存期≤2年的患者，尤以與半年內(nèi)死亡的患者有明顯差異。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示半年內(nèi)死亡的患者與生存期＞2年的患者PCNA PI之間有顯著差異（P＜0.01）；生存期半年～2年的患者與生存期＞2年的患者PCNA PI之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。AgNOR顆粒數(shù)與肝癌術(shù)后生存期有關(guān)，肝癌患者的AgNOR顆粒數(shù)隨著患者的生存期增高而減少，即生存期越短、AgNOR顆粒數(shù)越多，生存期越長(zhǎng)、AgNOR顆粒數(shù)越少。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示：生存期＞2年與半年內(nèi)死亡、生存期半年～2年與半年內(nèi)死亡患者的AgNOR顆粒數(shù)之間有顯著差異（P＜0.01）；生存期＞2年與生存期半年～2年差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。提示PCNA PI與肝細(xì)胞肝癌患者的預(yù)后有關(guān)，AgNOR顆粒數(shù)與肝細(xì)胞肝癌患者的預(yù)后有關(guān)。

表2 PCNA PI及AgNOR顆粒數(shù)與肝癌預(yù)后的關(guān)系（±s）

表2 PCNA PI及AgNOR顆粒數(shù)與肝癌預(yù)后的關(guān)系（±s）

預(yù)后 n PCNA PI（%） AgNOR顆粒數(shù)（個(gè)）生存期＞2年 15 18.05±5.51 3.35±1.05生存期半年～2年 41 27.52±6.20 4.14±1.65半年內(nèi)死亡 11 36.65±7.25 6.01±2.30

2.4 PCNA PI與AgNOR顆粒數(shù)的關(guān)系

由表3可見(jiàn)，生存期＞2年組中，隨PCNA分級(jí)的增高，AgNOR顆粒數(shù)有遞增的趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；由表4可見(jiàn)，半年內(nèi)死亡組中，PCNAⅡ級(jí)的AgNOR顆粒數(shù)有高于Ⅰ級(jí)的趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），PCNAⅠ級(jí)、PCNAⅡ級(jí)與PCNAⅢ級(jí)的AgNOR顆粒數(shù)之間差異有顯著性（P＜0.01）。67例患者中，隨PCNA分級(jí)的增高，AgNOR顆粒數(shù)增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表3 生存期＞2年的肝癌患者PCNA分級(jí)與AgNOR顆粒數(shù)的關(guān)系

表4 半年內(nèi)死亡的肝癌患者PCNA分級(jí)與AgNOR顆粒數(shù)關(guān)系

3 討論

PCNA是存在于細(xì)胞核中的一種非組蛋白，為DNA聚合酶的輔助蛋白，參與調(diào)節(jié)DNA合成，并影響細(xì)胞的增殖活動(dòng)，也是一種細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白，其表達(dá)的程度和含量反映了細(xì)胞增殖的活性，在G1早期開(kāi)始上升，S期達(dá)到高峰，G2、M期持續(xù)下降，G0期維持在極低水平[5]。在G1/S轉(zhuǎn)換期，PCNA發(fā)生磷酸化，再與DNA合成部位結(jié)合，激活DNA復(fù)制因子，促使增殖。因PCNA存在于增殖細(xì)胞核內(nèi)而靜止期細(xì)胞缺乏，故PCNA免疫組化染色可作為估計(jì)細(xì)胞增殖活性的指標(biāo)，并且其增殖指數(shù)分級(jí)與腫瘤分級(jí)、預(yù)后有一定關(guān)系[6]。本研究顯示，PCNA表達(dá)與肝癌組織學(xué)分級(jí)、腫塊大小及生存期有關(guān)。PCNA PI在高分化肝癌（10.70±7.12）、中分化肝癌（36.50±7.87）及低分化肝癌（61.60±16.38）中依次呈升高趨勢(shì)；腫瘤腫塊越大，其PCNA增殖指數(shù)越高；PCNA增殖指數(shù)越高，生存期越短。說(shuō)明PCNA高表達(dá)者增殖力較強(qiáng)，腫塊較大，組織學(xué)分級(jí)較高，分化程度較低，同時(shí)生存期縮短，預(yù)后較差。提示PCNA表達(dá)與肝細(xì)胞肝癌生物學(xué)行為有一定的關(guān)系，可作為預(yù)后指標(biāo)。

AgNOR是與rRNA相關(guān)的酸性非組蛋白，其功能是保持rRNA鏈伸展，調(diào)節(jié)rRNA轉(zhuǎn)錄，從而影響核糖體的形成和細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成。所以AgNOR顆粒數(shù)變化可以作為rDNA轉(zhuǎn)錄活性的指標(biāo)。由于其數(shù)量的多少可直接反映出細(xì)胞增殖活性的程度，所以將其作為細(xì)胞增殖，動(dòng)力學(xué)的重要參數(shù)用于腫瘤研究[7]。本研究結(jié)果表明AgNOR顆粒數(shù)與肝細(xì)胞肝癌組織學(xué)分級(jí)和預(yù)后關(guān)系上表現(xiàn)出AgNOR顆粒數(shù)的增多與肝細(xì)胞肝癌分化降低和生存期縮短有關(guān)，還表現(xiàn)出腫塊越大，AgNOR顆粒數(shù)增多。這說(shuō)明可以從AgNOR顆粒數(shù)變化的定量角度來(lái)判斷肝細(xì)胞肝癌的生物學(xué)特征和預(yù)后。

本研究結(jié)果尚顯示PCNA PI與AgNOR顆粒數(shù)在肝細(xì)胞肝癌的表達(dá)中呈正相關(guān)性，即隨著PCNA分級(jí)的增高，AgNOR顆粒數(shù)也增多（P＜0.01），提示結(jié)合PCNA PI和AgNOR顆粒數(shù)檢測(cè)能更加準(zhǔn)確反映肝癌細(xì)胞的增殖程度，判斷肝細(xì)胞肝癌的生物學(xué)行為和患者的預(yù)后。

PCNA是DNA合成中的重要調(diào)控因子，能夠客觀地反映細(xì)胞周期變化，而AgNOR則在rRNA的合成中發(fā)揮重要作用，可以反映蛋白質(zhì)的合成，二者均能較好地反映出腫瘤細(xì)胞的增殖活性。在原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌組織中，由于腫瘤細(xì)胞異常增殖，可表現(xiàn)為分化程度越低，PCNA PI增高；分化程度越低，AgNOR顆粒數(shù)增多。PCNA PI與腫瘤腫塊的大小及預(yù)后有關(guān)，AgNOR顆粒數(shù)也與腫瘤腫塊的大小及預(yù)后有關(guān)；同時(shí)在研究中還發(fā)現(xiàn)，PCNA PI與AgNOR顆粒數(shù)呈正相關(guān)性，在PCNA PI增高的同時(shí)，AgNOR顆粒數(shù)也增多。本研究顯示同時(shí)檢測(cè)PCNA PI和AgNOR顆粒數(shù)，可更加全面地了解腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為、增殖程度和患者的預(yù)后。因此聯(lián)合檢測(cè)PCNA PI與AgNOR顆粒數(shù)，可作為評(píng)價(jià)原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌的增殖與組織分級(jí)狀態(tài)的指標(biāo)，對(duì)判斷疾病的預(yù)后有重要的臨床價(jià)值。

[1] 孫振綱，陳孝平，黃志勇，等. 肝動(dòng)脈灌注碘油羥基磷灰石納米粒對(duì)兔VX2肝腫瘤細(xì)胞凋亡、增生及血管形成的影響[J]. 中華醫(yī)學(xué)雜志，2007，87（6）：409-413.

[2] 袁友紅，肖恩華，劉建濱，等. 兔肝VX2瘤化療栓塞介入術(shù)前后MR擴(kuò)散加權(quán)成像表現(xiàn)和增殖、轉(zhuǎn)移基因表達(dá)相關(guān)性的動(dòng)態(tài)研究[J].中華放射學(xué)雜志，2007，41（7）：761-765.

[3] Kuwano H，Sumiyoshi K，Nozoe T，et a1. The prognostic significance of the cytophotometric DNA content and its relationship with the argyrophilic nucleolar organizer regions（AgNOR）and proliferating cell nuclear antigen（PCNA）in oesophageal cancer[J]. Eur J Surg Oncol，1995，21（4）：368-373.

[4] Carmen C Yu，F(xiàn)letcher CD，Newman PL，et a1. A comparison of proliferating cell nuclear antigen（PCNA）immunostaining，Nucleolar organizer region（AgNOR）staining，and histological grading in gastrointestinal stromal tumors[J]. J Pathol，1992，166（2）：147-152.

[5] 李寧，王一平，祝慶孚，等. 增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）與胃癌預(yù)后的關(guān)系[J].中華腫瘤雜志，1993，15（1）：34-36.

[6] Flint A，Grossman HB，Liebert M，et a1. DNA and PCNA content of the renal cell carcinoma and prognosis[J]. AM J Clin Pathol，1995，103（1）：14-19.

[7] 楊興龍，郭夢(mèng)和. PCNA與AgNORs在鼻咽癌組織中表達(dá)的定量研究[J].中國(guó)腫瘤，2000，9（10）：475-477.