劉彥威,王斌,劉娜,劉利強,林燕

(河北工程大學農(nóng)學院,河北邯鄲056021)

新城疫(Newcastle disease,ND),又稱為亞洲雞瘟,是由新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)引起的一種高度接觸性傳染病,本病自1926年首次發(fā)生以來,已成危害養(yǎng)禽業(yè)發(fā)展的最嚴重的禽病之一。盡管對該病在診斷與防制方面進行了大量的研究,并取得了較大的成就,但目前尚無有效的治療方法[1-2]。

冬蟲夏草是一種名貴的中草藥材,含有多種藥理活性成份,比如核苷、多糖、甘露糖等。冬蟲夏草具有多種生物活性：抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤,抗菌,調(diào)節(jié)血脂等[3-4]。目前,冬蟲夏草的抗病毒活性報道較少。Ohta等[5]從北冬蟲夏草中分離出一種酸性多糖,發(fā)現(xiàn)該多糖可以降低甲型流感病毒(influenzaAvirus)感染小鼠肺泡灌洗液中流感病毒滴度,升高血清中TNF-alpha和IFN-gamm等細胞因子的水平,具有較強的抗流感病毒的活性。最近,實驗證明冬蟲夏草提取物具有抗人巨細胞病毒活性和抗甲型流感病毒的活性[6]。鑒于此,本課題擬研究冬蟲夏草是否具有抗雞NDV活性。由于野生冬蟲夏草的昂貴,本研究選用市面上可以買到的人工冬蟲夏草菌絲體為研究對象,采用低溫下水浸提的方法,獲取冬蟲夏草菌絲體粗提物,檢測其抗雞NDV活性。

1 材料和方法

1.1 儀器和試劑

DMEM培養(yǎng)基(Gibco);MTT(Sigma);Vero細胞和新城疫病毒由中國農(nóng)業(yè)大學傳染病室惠贈。酶標儀(MB-IV)：北京艾普生物設(shè)備有限公司, CO2培養(yǎng)箱(BC-J80S)：上海搏迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠,倒置顯微鏡。

1.2 方法

1.2.1 冬蟲夏草菌絲體水提物的配制

(1)在超凈工作臺中,取干燥菌絲體,放高速組織搗碎機,加入100mL水。溫度控制在4℃,置搖床上浸提105rpm,每次浸提24h,8 000rpm離心留取上清,共浸提3次,每次均加入100mL水,合并上清后,250mL試劑瓶分裝。

(2)放入-40℃冰箱,冷凍,真空冷凍干燥機冷凍干燥。得到浸膏后放-40℃冰箱保存,備用。

(3)取凍干菌絲體水提物,加入水,混勻,溶解后,用0.22μ m微孔濾膜過濾,放4℃冰箱備用,用細胞培養(yǎng)液(DMEM)稀釋成使用液。

1.2.2 MTT檢測

(1)待培養(yǎng)的Vero細胞鋪滿后,吸掉培養(yǎng)液上清,清洗兩次,加入配制好的0.05%胰酶消化貼壁細胞,待細胞變圓脫落后,加入含10%FBS的培養(yǎng)液終止反應(yīng)。

(2)將細胞吹勻后,計數(shù),轉(zhuǎn)入96孔板(104細胞/孔),其中第1列與第12列,加入不含細胞的培養(yǎng)液,放入CO2培養(yǎng)箱,37℃,5%CO2培養(yǎng)。

(3)24h后,觀察細胞,如呈較好分布,則加入等量梯度稀釋藥物,其中第11列不加藥物,作為對照。

(4)72h后,每孔分別加入含5mg/ml MTT的培養(yǎng)液30μ l,孵育6h。

(5)吸干上清后,加入DMSO 150μ l,在振蕩器上混勻5min。

(6)用酶標儀讀板,記錄OD570nm值。

1.2.3 病毒液TCID50(半數(shù)感染量)的測定

吸取已培養(yǎng)好Vero細胞的96孔培養(yǎng)板(Costar)的培養(yǎng)液,將新城疫病毒(F48株)用維持液分別配成原液的10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10懸液10管,接種在Vero細胞板中1h,吸棄病毒懸液,加維持液,每濃度梯度重復6孔,設(shè)空白對照和細胞對照。放于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),72h后觀察結(jié)果。CPE法判斷細胞病變程度見表1。按Reed-Muench公式計算TCID50。新城疫病毒的TCID50為10-5。

表1 細胞病變程度判定標準Tab.1 Standards for determining of cytopathic effect

1.2.4 水提物對新城疫病毒的直接作用

將TCID50(10-5)、10TCID50(10-4)、100TCID50(10-3)的新城疫病毒懸液分別與水提物混合,37℃水浴1h,加入培養(yǎng)Vero細胞的96孔細胞板中作用1h,吸棄液體,加維持液,每組重復6孔,并設(shè)無毒濃度藥品對照(僅加水提物)、細胞對照(病毒和水提物均不加)、病毒對照(僅接種病毒)。放于37℃,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),72h用CPE法觀察結(jié)果。

1.2.5 水提物對新城疫病毒的預防作用

將培養(yǎng)好Vero細胞的96孔板中的液體吸出,加入水提物 100μ L37℃作用1h,吸棄液體,加TCID50、10TCID50、100TCID50的新城疫病毒懸液100μ L 37℃作用1h,吸棄液體,并設(shè)無毒濃度藥品對照、細胞對照、病毒對照。放于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中作用48h,用CPE法觀察結(jié)果。

1.2.6 水提物對新城疫病毒的治療作用

將培養(yǎng)Vero細胞的96孔板中的液體吸出,加TCID50、10TCID50、100TCID50的新城疫病毒懸液100μ L37℃作用1h,吸棄液體,加入水提物100μ L 37℃作用1h,吸棄液體,并設(shè)無毒濃度藥品對照、細胞對照、病毒對照。放于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中作用48h,用CPE法觀察結(jié)果。所得結(jié)果進行秩和檢驗中的Ridit檢驗。

2 結(jié)果

2.1 浸膏的特征

菌絲體經(jīng)過粉碎、浸提、真空冷凍干燥后,形成浸膏,為褐色,較粘稠,但用水很容易將其融解,得到褐色的儲備液(100mg/mL),最后用培養(yǎng)液稀釋。

2.2 水提物的濃度與毒性

在選擇冬蟲夏草水提物的測試濃度時,當冬蟲夏草水提物濃度為1mg/mL時,對細胞具有代謝毒性,而為0.1mg/mL時,無代謝毒性。所以我們選擇2mg/mL,進行4倍系列稀釋,這樣可以保證有產(chǎn)生細胞毒性的濃度,也可保證較小的組間差別,而且梯度差別較大,OD值上可以表現(xiàn)出一定的差距。

當冬蟲夏草水提物濃度為2mg/mL時,在鏡下觀察細胞形態(tài),細胞邊界清晰,但是有些細胞已經(jīng)懸浮,細胞形態(tài)嚴重改變,胞質(zhì)中有異物感,細胞發(fā)生嚴重的細胞病變。而在0.5mg/mL的濃度下。與未添加藥物的細胞相比,鏡下觀察,沒有變化。同時采用 MTT法,當冬蟲夏草水提物濃度≤0.5mg/ml,發(fā)現(xiàn)細胞的活性基本沒有變化(表2)。

表2 菌絲體水提物的細胞毒性試驗Tab.2 Cytotoxicity assay of water extract from mycelium of Cordyceps sinensis

2.3 對病毒的作用

(1)直接殺滅作用。水提物在100TCID50病毒(10-3)時,對病毒抑殺作用不明顯(表3),在10TCID50病毒(病毒量為10-4)時,明顯抑制Vero細胞CPE形成,與病毒對照組統(tǒng)計學有顯著性差異(P＜0.05),在1TCID50病毒(毒量為10-5)時,基本可抑制Vero細胞CPE形成。病毒對照有明顯的細胞病變出現(xiàn),而藥物對照未見細胞病變,提示藥物對細胞沒有毒性作用。細胞對照也未出現(xiàn)病變。

表3 水提物抗病毒的直接殺滅作用Tab.3 Direct antivirus effect of Bran lectin on virus infection

(2)預防作用。水提物在 100TCID50病毒(10-3)和10TCID50病毒(10-4)時,對病毒抑殺作用不明顯(表4),在1TCID50病毒(10-5)時,明顯抑制Vero細胞CPE形成,與病毒對照組統(tǒng)計學有顯著性差異(P＜0.05)。病毒對照有明顯的細胞病變出現(xiàn),而藥物對照未見細胞病變,提示藥物對細胞沒有毒性作用。細胞對照也未出現(xiàn)病變。

表4 水提物對病毒的預防作用Tab.4 Preventive effect of Bran lectin on virus infection

(3)治療作用。水提物對不同濃度的病毒均沒有治療作用(表5)。病毒對照有明顯的細胞病變出現(xiàn),而藥物對照未見細胞病變,提示藥物對細胞沒有毒性作用。細胞對照也未出現(xiàn)病變。

表5 水提物對病毒的治療作用Tab.5 Therapeutic effect of Bran lectin on virus infection

3 結(jié)論

1)大體積溶劑低溫浸提,可以充分溶解成份,從而減小了低溫下某些成份溶解速度慢,溶解度低的弊端。

2)0.5mg/ml冬蟲夏草水提物對細胞的代謝無影響。

3)體外實驗發(fā)現(xiàn)水提物對病毒具有預防和抑殺作用,而對細胞沒有毒性,是一種低毒的體外抗新城疫病毒物質(zhì),具有潛在的抗雞新城疫病毒臨床應(yīng)用價值。

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