王又紅,郭琳琳,劉衛(wèi)紅,李 強(qiáng)

(1.河南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院,河南鄭州 450000;2.河南中醫(yī)學(xué)院,河南鄭州 450008)

梔子又名山梔子、黃梔子,為茜草科植物梔子(Gardenia jasminoides Ellis)的干燥成熟果實(shí),具有利膽、鎮(zhèn)痛、降壓和抑菌抗炎等作用[1]。臨床常用中藥中許多方劑中含有梔子,梔子苷是梔子中具有顯著生理活性的成分。本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜(HPLC)法測定注射梔子苷后梔子苷在大鼠體內(nèi)的血藥濃度,研究注射梔子苷后梔子苷在體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)特征,以期為梔子及其有效成分的合理使用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng) 物

SPF級SD大鼠,雄性,體質(zhì)量220 g左右,由河南醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供,動(dòng)物質(zhì)量許可證號: SCXK(豫)2010-0002。

1.2 藥品與試劑

梔子苷對照品,購于中國藥品檢驗(yàn)所,批號110749-200613;90%梔子苷,購于四川雙子葉生物科技有限公司,批號SZY081216;甲醇為色譜醇,迪馬公司產(chǎn)品;水為自制純凈水,其余試劑均為分析純。

1.3 儀 器

Sartorious CP 225D型電子天平,產(chǎn)地德國;美國Waters 2695型高效液相色譜儀(包括自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)、四元泵、在線真空脫氣、Waters 2996PDA-二極管陣列檢測器);QL-901旋渦混合器,海門市其林貝爾儀器制造有限公司產(chǎn)品;BF-2000氮?dú)獯蹈蓛x,北京八方世紀(jì)科技有限公司產(chǎn)品;SZ-93自動(dòng)雙重純水蒸餾器,上海亞榮生化儀器廠產(chǎn)品。

1.4 色譜條件[2]

Agilent Eclipse XDB-C18(150 mm×4.6 mm, 5μm),流動(dòng)相為甲醇∶水(30∶70);體積流量為1.0mL/min;檢測波長為238 nm;柱溫為30℃,進(jìn)樣量為10μL。

1.5 對照品溶液的制備

精密稱取梔子苷對照品 10 mg,用甲醇溶解于10mL容量瓶中,定容至刻度,即得濃度為1 g/L的梔子苷對照品母液,將母液稀釋配制成系列質(zhì)量濃度的梔子苷對照品溶液。

1.6 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法

對SD大鼠進(jìn)行頸靜脈插管手術(shù),將術(shù)后恢復(fù)正常的健康大鼠用于梔子苷的藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)。給藥前將插管大鼠禁食不禁水 12 h,每只大鼠按12.5μg/g的劑量尾靜脈注射給予梔子苷,分別于給藥后 1,5,10,20,30,40,60,90,120,180 min經(jīng)頸靜脈插管取血0.5m L于肝素化離心管中,6 000 r/min離心15 min,分離出血漿,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 血漿樣品預(yù)處理[2-5]

吸取 200μL血漿置離心管中,加甲醇∶乙腈(3∶1)的混合溶劑 800μL沉淀蛋白,渦旋混勻1m in,6 000 r/min離心15min,吸取上清液,氮?dú)鈿饬飨麓蹈?殘?jiān)尤肓鲃?dòng)相 100μL溶解,超聲5m in,15 000 r/min離心15 min,吸取上清液,進(jìn)樣檢測分析。

2 結(jié) 果

2.1 專屬性試驗(yàn)

在上述的色譜條件下,測得梔子苷對照品溶液、大鼠空白血漿、大鼠空白血漿加梔子苷對照品溶液及注射梔子苷后血漿樣品色譜圖(見圖1)。由圖可知梔子苷的峰形良好,保留時(shí)間約為5.2 min,分離度大于 1.5,空白血漿樣品中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾梔子苷血藥濃度的分析。

圖1 梔子苷對照品溶液、大鼠空白血漿、大鼠空白血漿加梔子苷對照品溶液及注射梔子苷后血漿樣品色譜圖

2.2 線性關(guān)系考察

取大鼠空白血漿200μL,分別加入不同濃度的梔子苷對照品溶液100μL,配制成濃度為0.1,0.2, 0.4,1.0,2.0,4.0,10.0,20.0,40.0,100.0, 200.0 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品,除不加 100μL甲醇外,其他按照 1.7項(xiàng)下的方法操作處理樣品,按1.4項(xiàng)中所述色譜條件下進(jìn)樣測定,記錄梔子苷的峰面積,并以梔子苷的峰面積(A)對梔子苷質(zhì)量濃度(C)進(jìn)行線性回歸,所得梔子苷標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程: A=46 573C+2 011.7(R2=0.999 6,0.1～4 mg/L)和A=43 426C+65 321(R2=0.999 2,4～200 mg/L),血漿藥物濃度在0.1～200mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,定量下線為0.1 mg/L。

2.3 回收率試驗(yàn)

取空白血漿 200μL,分別制備低、中、高 3個(gè)濃度(0.2,4,100mg/L)的標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品,按1.7項(xiàng)下方法處理,按 1.4項(xiàng)中所述色譜條件下進(jìn)樣測定,平行操作 5次,以標(biāo)準(zhǔn)曲線求算實(shí)測濃度,與理論濃度進(jìn)行比較,計(jì)算回收率。其低、中、高 3個(gè)濃度的回收率分別為96.37±4.05,98.82±3.08,100.49± 2.64,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD值分別為4.20%、3.12%、2.63%(n=5)。

2.4 精密度試驗(yàn)

分別配制低、中、高 3個(gè)質(zhì)量濃度(0.2,4.0, 100.0mg/L)的標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品,按1.7項(xiàng)下方法處理,按 1.4項(xiàng)中所述色譜條件下進(jìn)樣測定,每個(gè)濃度的樣品制備 5份,當(dāng)天將樣品進(jìn)行檢測,以評價(jià)日內(nèi)精密度。同法連續(xù)5 d內(nèi),每天測定低、中、高 3個(gè)濃度的樣品,每個(gè)濃度 5份,以評價(jià)日間精密度。結(jié)果表明:日內(nèi)精密度的 RSD值分別為5.15%、2.93%、2.37%,日間精密度的 RSD值分別為5.76%、3.16%、2.67%(n=5)。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

分別取低、中、高 3個(gè)質(zhì)量濃度(0.2,4.0, 100.0 mg/L)的血漿樣品,每個(gè)濃度5份,將樣品按1.7項(xiàng)下方法處理,于制備后 0,2,4,8,12 h按 1.4項(xiàng)中所述色譜條件下進(jìn)樣測定,計(jì)算RSD值,3個(gè)濃度的RSD值分別為3.60%、2.04%、2.43%。結(jié)果表明標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品室溫放置 12 h穩(wěn)定性良好。同法配制低、中、高 3個(gè)質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品,保存于 -20℃冰箱中,分別于 0,1,2,3,4 d取出,于室溫下融化,按所建的方法操作測定,計(jì)算RSD值、3個(gè)濃度的RSD值分別為4.19%、2.72%、2.52%。結(jié)果表明標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品的凍存穩(wěn)定性良好。

2.6 藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)

運(yùn)用3P87藥代動(dòng)力學(xué)程序計(jì)算梔子苷的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù),按房室模型進(jìn)行模擬,結(jié)合AIC值最小和相關(guān)系數(shù) r值最大原則,結(jié)果表明,注射梔子苷后梔子苷在大鼠體內(nèi)的過程符合三室模型。其藥時(shí)曲線見圖 2,主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)見表 1。

圖2 梔子苷在大鼠體內(nèi)的血藥濃度-時(shí)間曲線

表1 梔子苷在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)在選擇液相色譜方法時(shí),參考相關(guān)文獻(xiàn)[2-3,5-7],曾采用不同比例的甲醇 -水,乙腈 -水作流動(dòng)相,實(shí)驗(yàn)表明在甲醇∶水 -30∶70的流動(dòng)相條件下,梔子苷峰形態(tài)良好,保留時(shí)間適中;血漿樣品處理過程中,由于梔子苷為環(huán)烯醚萜苷,極性較大,在乙酸乙酯中溶解性較小,因而提取回收率比較低,達(dá)不到實(shí)驗(yàn)的要求,故選用有機(jī)溶劑沉淀蛋白的方法[3],嘗試用甲醇或乙腈沉淀蛋白。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)用甲醇時(shí)沉淀雜質(zhì)不完全,而用乙腈沉淀蛋白時(shí)實(shí)驗(yàn)的回收率不高,參考文獻(xiàn)[4]選用甲醇、乙腈的混合溶劑作沉淀劑,實(shí)驗(yàn)效果較好。本實(shí)驗(yàn)建立的測定大鼠血漿中梔子苷含量的高效液相色譜法準(zhǔn)確可靠,適合生物樣品的測定要求。通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知大鼠注射梔子苷后的體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)過程符合三室模型, T1/2β為 38.614 min左右,說明梔子苷消除快,在體內(nèi)滯留時(shí)間短;T1/2β大于T1/2α說明梔子苷在大鼠體內(nèi)主要以消除過程為主。本實(shí)驗(yàn)明確了注射梔子苷后梔子苷在體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)特征,并獲得了相關(guān)的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù),以期為梔子及其有效成分的合理應(yīng)用提供參考。

[1]陰健.中藥現(xiàn)代研究與臨床應(yīng)用[M].北京:學(xué)苑出版社,1993:417.

[2]丁光超,王芳芳,葉肖栗.黃連解毒膠囊中梔子苷在大鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究[J].西北藥學(xué)雜志,2009,24(1): 50-51.

[3]肖學(xué)鳳,喬曉莉,高嵐,等.黃連解毒湯中梔子苷在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)研究[J].天津中醫(yī)藥,2008,25(4):328-329.

[4]高榮.銀黃注射液和銀黃口服液在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué) -藥效學(xué)研究和代謝組學(xué)初步研究[D].成都:四川大學(xué), 2007.

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