王振亮,姚乃禮

(1.河南中醫(yī)學(xué)院仲景醫(yī)藥研究所,河南鄭州 450008;2.中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院,北京 100053)

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種以對稱性、多關(guān)節(jié)、小關(guān)節(jié)病變?yōu)橹鞯穆?、全身性、進(jìn)行性、自身免疫性疾病,因可引起多系統(tǒng)、多器官的病變,又稱為類風(fēng)濕病[1]。其發(fā)病機制迄今未明,也無特異性的治療藥物。筆者以補益肝腎、化痰活血通絡(luò)為治法研制了石藤膠囊,并就其對大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎(ad juvantarthritis,AA)關(guān)節(jié)病變的影響進(jìn)行了觀察,總結(jié)報道如下。

1 材料與方法

1.1 動 物

清潔級健康Wistar大鼠60只,雌雄各半,2月齡,體質(zhì)量 150～180 g,由河北省實驗動物中心提供,動物質(zhì)量合格證號:0804102。

1.2 藥品與試劑

石藤膠囊為院內(nèi)制劑,0.5 g/粒,由河南省安陽151醫(yī)院制劑室提供,制劑批號為 070510;雷公藤多苷片,10mg/片,黃石飛云制藥有限公司產(chǎn)品,批號為 061101。注射用卡介苗,60 mg/支,由上海生物制品研究所提供,批號為 20080215。羊毛脂,由天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所提供,批號為 20070923;關(guān)節(jié)組織核因子κB受體激活配體(receptoractivator of NF-κB ligand,RANKL)、骨保護(hù)素(osteoprotegerin,OPG)大鼠ELISA試劑盒,上海西唐生物科技有限公司提供;OPG羊抗鼠和RANKL羊抗鼠,美國Santa Cruz公司產(chǎn)品;SP試劑盒和DAB顯色試劑盒,由北京中山公司提供。

1.3 模型的建立

動物實驗性喂養(yǎng) 2周后,參照文獻(xiàn)[2]方法,以卡介苗與不完全弗氏佐劑充分乳化混勻配成10 g/L的乳劑,于每鼠右后足跖皮內(nèi)注射0.05 mL致炎。

1.4 分組與給藥

造模后第 19天,隨機選取出現(xiàn)多發(fā)性關(guān)節(jié)炎癥狀的大鼠 40只,并隨機分為模型對照組,石藤膠囊大、中、小劑量組,雷公藤組,每組 8只。將注射生理鹽水大鼠作為正常對照組。分別測雙側(cè)后足爪容積后,各組按每日10μL/g連續(xù)灌胃給藥或給等體積生理鹽水,持續(xù) 21 d。石藤膠囊小、中、大劑量組每日依次灌服石藤膠囊450,600,750μg/g;雷公藤組每日灌服雷公藤多苷片 6μ/g;模型對照組和正常對照組灌服等體積的生理鹽水。于給藥結(jié)束后第 2天再次測量各組大鼠足爪容積,經(jīng)腹主動脈采血, 3 500 r/min離心10min,取血清,-70℃冰箱保存待測。

1.5 檢測指標(biāo)

1.5.1 足爪腫脹抑制率

用適當(dāng)濃度苦味酸溶液(2,4,6-三硝基苯酚)于大鼠踝關(guān)節(jié)處做一標(biāo)記。測量時,將大鼠后肢浸入容積杯中使踝關(guān)節(jié)標(biāo)記與液面重疊,抽吸上升液體至原液面水平,計算液體量,即為實測足爪容量。

腫脹率(%)=(致炎后足爪容積-致炎前足爪容積)/致炎前足爪容積×100%。

1.5.2 關(guān)節(jié)炎指數(shù)積分

采用關(guān)節(jié)炎指數(shù)積分法[3]。根據(jù)未注射完全佐劑的其余 3個肢體的關(guān)節(jié)紅腫程度、范圍及關(guān)節(jié)腫大變形情況,累計得出關(guān)節(jié)炎指數(shù)。0分:無關(guān)節(jié)炎。1分:關(guān)節(jié)表面有紅色斑點或關(guān)節(jié)部位輕度腫脹。2分:關(guān)節(jié)部中度腫脹。3分:關(guān)節(jié)部位嚴(yán)重腫脹。4分:關(guān)節(jié)部位嚴(yán)重腫脹,且不能負(fù)重。

1.5.3 大鼠關(guān)節(jié)病理積分

大鼠取血后立即取踝關(guān)節(jié),用 4%多聚甲醛溶液固定,10%EDTA溶液脫鈣20 d,常規(guī)石蠟包埋切片,行蘇木精-伊紅(HE)染色,常規(guī)光鏡觀察滑膜增生、炎性細(xì)胞浸潤、軟骨骨質(zhì)破壞及關(guān)節(jié)周圍組織水腫等組織形態(tài)變化,并根據(jù)文獻(xiàn)[4]方法進(jìn)行半定量評分。標(biāo)準(zhǔn)如下:關(guān)節(jié)具有正常的結(jié)構(gòu)(如關(guān)節(jié)間隙、軟骨、骨和滑膜組織等),計0分;關(guān)節(jié)組織中有纖毛形成和輕度的關(guān)節(jié)炎癥,并有滑膜增生,血管數(shù)量增加,以及小的炎性細(xì)胞灶,無軟骨和骨的侵蝕破壞,計 1分;關(guān)節(jié)有軟骨的侵蝕破壞,有中度的關(guān)節(jié)炎癥,有大量炎細(xì)胞浸潤,滑膜增生和血管翳形成較嚴(yán)重,無骨破壞,關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)無破壞,計 2分;有嚴(yán)重的血管翳形成,廣泛的軟骨侵蝕破壞,可見骨破壞,關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)破壞,計 3分。

1.5.4 大鼠關(guān)節(jié)中RANKL、OPG的表達(dá)

行免疫組化檢驗的切片二甲苯脫蠟,梯度酒精去除二甲苯后,以磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次,每次3min,0.3%過氧化氫-甲醇溶液37℃溫育45 min。純化水沖洗,PBS浸泡5m in,微波抗原修復(fù)30min。PBS洗3次,每次3 min,滴加羊抗鼠RANKL (1∶200)或羊抗鼠OPG(1∶200),4℃孵育過夜。陰性對照用PBS代替一抗。PBS洗3次,每次3 min,滴加生物素化的兔抗羊二抗,37℃溫育30 min。PBS洗3次,每次3 min,滴加鏈霉素-辣根過氧化物酶標(biāo)記的三抗,37℃溫育30 min。PBS洗3次,每次3 min,DAB顯色,脫水、透明中性樹膠封片。

RANKL、OPG表達(dá)的計數(shù)方法:RANKL陽性細(xì)胞為細(xì)胞膜或胞漿呈橘黃色或棕黃色,RANKL蛋白主要表達(dá)于滑膜、局部骨侵蝕處。每張切片在 400倍鏡下隨機挑選 10個視野,每個視野查 100個細(xì)胞,分別計算每個視野中RANKL陽性細(xì)胞數(shù)占該區(qū)域中細(xì)胞總數(shù)的百分?jǐn)?shù),求其平均值。OPG陽性的細(xì)胞為細(xì)胞質(zhì)著色,呈顆粒狀的棕黃色或棕褐色。OPG主要由成骨細(xì)胞表達(dá),也可見于滑膜細(xì)胞。每張切片在 400倍鏡下隨機挑選 10個視野,每個視野查100個細(xì)胞,分別計算每個視野中OPG陽性細(xì)胞數(shù)占該區(qū)域中細(xì)胞總數(shù)的百分?jǐn)?shù),求其平均值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計分析軟件處理。計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)(BZ_139_2138_999_2156_1045)±標(biāo)準(zhǔn)差(s)表示,各組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。方差分析前進(jìn)行齊性檢驗,采用LSD進(jìn)行統(tǒng)計。以P＜0.05為差別有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 石藤膠囊對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠足爪腫脹抑制率的影響

大鼠右后足接種完全弗氏佐劑后約9 d,前肢及左后足出現(xiàn)關(guān)節(jié)炎癥狀,約24 d后紅、腫等炎癥表現(xiàn)達(dá)到高峰。見表 1。

表1 各組大鼠足爪腫脹抑制率對比%,±s

表1 各組大鼠足爪腫脹抑制率對比%,±s

注:與模型對照組對比,**P＜0.01;與石藤膠囊大劑量組對比,#P＜0.05。

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2.2 石藤膠囊對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)的影響

見表2。

表2 給藥前后各組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)對比 分,±s

表2 給藥前后各組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)對比 分,±s

注:與模型對照組對比,**P＜0.01;與石藤膠囊小劑量組對比,#P＜0.05。

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2.3 石藤膠囊對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)病理積分的影響

見表3。

表3 各組大鼠踝關(guān)節(jié)病理積分對比 分,±s

表3 各組大鼠踝關(guān)節(jié)病理積分對比 分,±s

注:與模型對照組對比,*P＜0.05;與石藤膠囊大劑量組對比, #P＜0.05。

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2.4 石藤膠囊對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)中RANKL、OPG表達(dá)的影響

見表4。

表4 各組大鼠關(guān)節(jié)中RANKL、OPG表達(dá)對比%,±s

表4 各組大鼠關(guān)節(jié)中RANKL、OPG表達(dá)對比%,±s

注:與正常對照組對比,**P＜0.01;與模型組對比,#P＜0.01;與石藤膠囊大劑量組對比,△P＜0.05;與雷公藤組對比,＊P＜0.05。

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3 討 論

中醫(yī)學(xué)無 RA病名,對其認(rèn)識散見于“痹證”、“歷節(jié)”、“痛風(fēng)”等病證中。本病多以肝腎虧虛為發(fā)病之本,外感之邪為發(fā)病誘因。因病程長久,久病多瘀、久病入絡(luò),以致痰凝血瘀,痹阻絡(luò)脈,流注筋骨、關(guān)節(jié)、肌肉、血脈而為病。用補益肝腎法治療 RA可謂“正其本”。痰瘀痹阻的存在使 RA久羈難愈,而久治不愈又加重了痰瘀的痹阻,兩者形成惡性循環(huán),故用化痰活血法治療RA可謂“暢其流”。依此筆者以補益肝腎、化痰活血通絡(luò)為法研制了石藤膠囊。方中石楠藤祛風(fēng),通絡(luò)益腎,治風(fēng)痹、腰背酸痛[5];雷公藤祛風(fēng)通絡(luò),消腫止痛,可助石楠藤以通絡(luò)止痛;懷牛膝補肝腎,強筋骨,活血通經(jīng),“治腰膝骨痛,足痿筋攣”(《本草備要》);三七有散瘀止血,消腫定痛功能[6],又可助石楠藤活血之不逮,益其止痛之功能;萊菔子 “化痰除風(fēng),散邪發(fā)汗”(《本草再新》),長于利氣,既可化痰通利關(guān)節(jié),也能防滋補礙胃之弊,與三七配伍,能化痰活血以除痰瘀之痹阻,通行經(jīng)絡(luò)而止不通之疼痛。全方共奏補益肝腎、化痰活血通絡(luò)之效。

本實驗結(jié)果顯示,石藤膠囊可明顯降低 AA大鼠的足爪腫脹度,提高對關(guān)節(jié)腫脹的抑制率,在減輕滑膜的病理改變(滑膜水腫、增生和炎細(xì)胞浸潤,軟骨的破壞)方面,療效明顯優(yōu)于雷公藤多苷,且隨著用藥量的增加,效果越明顯。RA關(guān)節(jié)的破壞包括滑膜、軟骨、軟骨下骨的侵蝕,雖然對造成這些關(guān)節(jié)破壞的機制尚未完全闡明,但破骨細(xì)胞(osteoclast, OC)在其中的作用已被大量的實驗所證實[7]。它所介導(dǎo)的骨破壞是通過細(xì)胞間相互作用和多種細(xì)胞因子調(diào)控實現(xiàn)的,其中RANKL/OPG系統(tǒng)處于中心地位,RANKL可以直接激活OC細(xì)胞膜上的NF-κB受體活化因子(receptor activator of NF-κB, RANK)。OPG又稱破骨細(xì)胞抑制因子,主要抑制OC的分化、活化成熟以及細(xì)胞數(shù)量,是RANKL的天然阻滯受體,可阻斷其與RANK的結(jié)合[8]。有學(xué)者[9]發(fā)現(xiàn),在RA患者骨關(guān)節(jié)中RANKL的表達(dá)相對OPG局限,大多分布于破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨質(zhì)破壞處,即關(guān)節(jié)面血管翳與骨的交界處。OPG可在滑膜組織多數(shù)細(xì)胞中表達(dá),但具有傾向分布于有RANKL表達(dá)的骨質(zhì)破壞處的特點,這也進(jìn)一步說明了 OPG阻滯RANKL對骨破壞的作用。目前認(rèn)為RANKL是前體破骨細(xì)胞分化、成熟的啟動因子[10]。臨床觀察也發(fā)現(xiàn)[11],RA患者血清、滑液中OPG水平降低, RANKL、RANK水平升高。本實驗觀察到,AA大鼠的滑膜、軟骨下骨、骨小梁局灶侵蝕處可見RANKL表達(dá)增高,在軟骨下骨、骨小梁區(qū)域有OPG的高表達(dá),這和文獻(xiàn)報道[12-13]一致。實驗結(jié)果還表明,關(guān)節(jié)中OPG的表達(dá)水平模型對照組明顯低于正常對照組,RANKL的表達(dá)水平模型對照組明顯高于正常對照組,證明AA的關(guān)節(jié)骨質(zhì)破壞是由破骨細(xì)胞通道激活所引起的。石藤膠囊各劑量組的OPG表達(dá)明顯高于模型對照組,RANKL表達(dá)明顯低于模型對照組,石藤膠囊中、小劑量組與模型對照組對比,差別也有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),但療效不及大劑量組。表明石藤膠囊在保護(hù) AA骨破壞方面有良好效果,同時有一定的量效關(guān)系。石藤膠囊通過抑制破骨細(xì)胞通道防治骨破壞可能是其治療RA的作用機制之一。

雷公藤多苷是我國自行開發(fā)的抗風(fēng)濕藥,對RA有較好療效。本實驗表明石藤膠囊改善關(guān)節(jié)腫脹的效果好于雷公藤多苷(P＜0.01),改善RANKL、OPG指標(biāo)方面與雷公藤多苷相當(dāng)(P＞0.05),說明石藤膠囊對 AA有明顯效果,值得進(jìn)一步研究。

[1]路志正,焦樹德.實用中醫(yī)風(fēng)濕病學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,1996:453.

[2]徐叔云,卞如濂,陳修.藥理實驗方法學(xué)[M].3版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2002:920.

[3]韓曉楓,馬寶驪,張繼英,等.雞Ⅱ型膠原誘導(dǎo)大鼠類風(fēng)關(guān)模型的建立[J].上海免疫學(xué)雜志,2002,21(6):330-333.

[4]Kenneth W.Apdolph:human genome methods[M].New York:CRCPress,1998:224.

[5]江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典[M].上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,1986:606.

[6]陳可冀,史載祥.實用血瘀證學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,1999:159-161.

[7]王霖,王文杰.破骨細(xì)胞在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎骨破壞中的作用及其調(diào)控機制[J].生理科學(xué)進(jìn)展,2004,35(3): 269-272.

[8]Gravallese EM.Bone destruceion in arthritis[J].Ann Rheum Dis,2002,61:84-86.

[9]Pettit AR,Walsh NC,Manning C,et al.RANKL protein is xpressed at the pannus2bone interface atsites of articular bone erosion in rheumatoid arthritis[J].Rheumatology (Oxford),2006,Epub ahead of print.

[10]Yasuda H,Shima N,Nakagawa N,etal.Osteoclast differentiationfactor is a ligand for osteoprotegeriny osteoclastogenesisinhibitory factor and is identical to TRANCE/RANKL[J]. Proc Natl Acad SciUSA,1998,95:3597-3602.

[11]樊秋貴,郭鈞,楊民.OPG、RANKL、RANK等因子在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者血清及滑膜液中的變化及意義[J].中華風(fēng)濕病學(xué)雜志,2007,11(1):38-40.

[12]羅波,胡永紅,張明敏,等.雷公藤多苷對佐劑性關(guān)節(jié)炎模型大鼠關(guān)節(jié)中核因子 κB受體激活劑配基表達(dá)的影響[J].醫(yī)藥導(dǎo)報,2006,25(5):395-397.

[13]戴生明.破骨細(xì)胞的分化與激活及其在關(guān)節(jié)炎骨質(zhì)破壞中的作用[J].中華風(fēng)濕病學(xué)雜志,2004,8(5):312-314.