杜小正,方曉麗,東貴榮

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院針灸科,上海 200437;2.甘肅中醫(yī)學(xué)院針灸推拿系,甘肅蘭州 730000)

筆者前期的實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果證明,熱補(bǔ)針法即時(shí)鎮(zhèn)痛效應(yīng)與捻轉(zhuǎn)針法相同,而后效應(yīng)優(yōu)于捻轉(zhuǎn)針法,并證明與外周炎癥局部鎮(zhèn)痛物質(zhì)的變化也有關(guān)[1-2],推測(cè)兩種針法不同的鎮(zhèn)痛后效應(yīng)與中樞鎮(zhèn)痛物質(zhì)的變化也有關(guān)。筆者以卵蛋白誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎兔為疼痛模型,探求熱補(bǔ)針法的針刺鎮(zhèn)痛后效應(yīng)及中樞作用機(jī)制,以期為臨床治療痛證提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng) 物

健康2～3月齡青紫藍(lán)兔 70只,體質(zhì)量(2.5± 0.5)kg,雌雄各半,由衛(wèi)生部蘭州生物制品研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào):醫(yī)動(dòng)字第甘肅省14-021號(hào)。

1.2 主要儀器與試劑

SN-695B型智能放免γ測(cè)量儀,上海日環(huán)產(chǎn)品;FA2004N型電子分析天平,上海精密科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品;TG-16G型臺(tái)式離心機(jī),上海安亭產(chǎn)品;WQ-9E測(cè)痛儀,北京海淀區(qū)電子儀器廠產(chǎn)品;卵蛋白干粉及完全弗氏佐劑,上海升正產(chǎn)品,批號(hào)為200712;β-EP、CCK-8放免試劑盒,第二軍醫(yī)大學(xué)神經(jīng)生物教研室產(chǎn)品。

1.3 動(dòng)物分組

將已馴養(yǎng)1周并測(cè)痛閾在1.8mA左右、能引起縮腿反應(yīng)的 60只青紫藍(lán)兔用于實(shí)驗(yàn)。痛閾測(cè)定小于1.30mA或大于2.30 mA者為動(dòng)物反應(yīng)過敏或遲鈍,棄之不用。將 60只兔按體質(zhì)量隨機(jī)分為正常組(n=6)、模型組(n=6)、捻轉(zhuǎn)組(n=24)和熱補(bǔ)組(n=24),后2組又隨機(jī)分為針后即時(shí)(0 h)和針后0.5,1,2 h亞組,每亞組各6只。

1.4 動(dòng)物模型的建立

模型組以及捻轉(zhuǎn)組、熱補(bǔ)組各亞組均采用卵蛋白誘導(dǎo)法建立關(guān)節(jié)炎疼痛模型[3]。方法:于造模前3 d用脫毛劑脫去家兔雙側(cè)后腿膝關(guān)節(jié)周圍和背部肩胛骨間的毛。將4 g/L的卵蛋白溶液與等量完全弗氏佐劑混勻,充分震蕩成乳化劑。在兔肩背部均勻選6個(gè)點(diǎn),每點(diǎn)皮下注射該溶液0.2 mL。14 d后以相同劑量重復(fù)皮下注射 1次。第 2次免疫后 6 d,在兔雙膝關(guān)節(jié)內(nèi)分別注入 20 g/L卵蛋白生理鹽水溶液0.4mL。在24 h之內(nèi)關(guān)節(jié)出現(xiàn)紅腫,表示造模成功。

1.5 針刺治療

在兔雙膝關(guān)節(jié)內(nèi)注入卵蛋白生理鹽水溶液后第7天針刺治療雙側(cè)后腿足三里和雙側(cè)前腿的合谷穴(取穴參照林文注《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》家兔常用針灸穴位定位標(biāo)準(zhǔn)并以對(duì)比解剖學(xué)為依據(jù)定位)1次。方法:將針直刺入穴內(nèi) 0.8～1.2 cm,捻轉(zhuǎn)組施以前后捻轉(zhuǎn)的手法,指力均勻,角度適當(dāng)(180～360度),雙向捻轉(zhuǎn),每穴操作1min,留針30 min;熱補(bǔ)組用熱補(bǔ)針法,右手拇指向前連續(xù)捻按針柄 3～5次,待針下沉緊,針尖拉著有感應(yīng)的部位,連續(xù)重插輕提 3～5次,拇指再向前連續(xù)捻按針柄 3～5次,針尖頂著產(chǎn)生感覺的部位守氣1min,留針30min。正常組和模型組青紫藍(lán)兔以同樣的方式固定30min,不做其他處理。

1.6 檢測(cè)指標(biāo)

痛閾:各治療組在治療后即時(shí)、0.5 h、1 h和2 h測(cè)痛閾。檢測(cè)方法參照文獻(xiàn)[4]。在右膝關(guān)節(jié)表面安裝含有飽和KCL溶液的電極,無關(guān)電極接右前肢,兩極與WQ-9E測(cè)痛儀相連,用電流強(qiáng)度線型遞增的直流電將 K+導(dǎo)入皮膚,做疼痛刺激。以右后腿的收縮性反應(yīng)作為疼痛指標(biāo),以引起家兔腿收縮的最小電流強(qiáng)度作為痛閾。共測(cè) 3次,每次之間間隔5 min,取其平均值作為痛閾。

β-EP、CCK-8:測(cè)完痛閾后將家兔以30%烏拉坦按1 g/kg經(jīng)耳緣靜脈注射麻醉,取側(cè)臥位用7號(hào)靜脈穿刺針經(jīng)枕外隆凸下 0.5 cm處進(jìn)入小腦延髓池,抽取腦脊液 1m L,注入提前浸在冰浴中的收集管中,立即在沸生理水中煮5 min,4℃,4 000 r/min離心 20 min,取上清液,-20℃低溫保存待測(cè)。采用放射免疫技術(shù)測(cè)定β-EP和CCK-8的含量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件處理。計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)(BZ_139_2138_999_2156_1045)±標(biāo)準(zhǔn)差(s)表示,各組間均數(shù)對(duì)比用單因素方差分析(ANOVA),組間均數(shù)的兩兩對(duì)比,方差齊時(shí)選擇LSD法,方差不齊時(shí)選擇Dunnett T3法。以 P＜0.05為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 熱補(bǔ)針法對(duì)家兔關(guān)節(jié)局部痛閾值的影響

模型組痛閾顯著低于正常組(P＜0.01);與0 h模型組對(duì)比,捻轉(zhuǎn)組和熱補(bǔ)組針后各時(shí)刻痛閾均顯著升高(P＜0.01或P＜0.05),但均低于0 h正常組(P＜0.01);熱補(bǔ)組即時(shí)痛閾與捻轉(zhuǎn)組即時(shí)痛閾對(duì)比,差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05);熱補(bǔ)組其他時(shí)間點(diǎn)痛閾均顯著高于捻轉(zhuǎn)組(P＜0.05或P＜0.01)。見表 1。

表1 各時(shí)間點(diǎn)各組家兔關(guān)節(jié)局部痛閾值對(duì)比 mA,±s

表1 各時(shí)間點(diǎn)各組家兔關(guān)節(jié)局部痛閾值對(duì)比 mA,±s

注:與0 h正常組對(duì)比,**P＜0.01;與0 h模型組對(duì)比,#P＜0.05,##P＜0.01;與捻轉(zhuǎn)組相同時(shí)間點(diǎn)對(duì)比,△P＜0.05,△△P＜0.01。

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2.2 熱補(bǔ)針法對(duì)家兔腦脊液中β-EP含量的影響

模型組腦脊液中β-EP含量高于正常組(P＜0.01);與 0 h模型組對(duì)比,捻針組和熱補(bǔ)組各時(shí)刻β-EP含量均顯著性升高(P＜0.01);熱補(bǔ)組即時(shí)β-EP含量與捻轉(zhuǎn)組即時(shí) β-EP含量對(duì)比差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);其他時(shí)刻β-EP含量,熱補(bǔ)組均明顯高于捻轉(zhuǎn)組(P＜0.05或P＜0.01)。見表2。

表2 各時(shí)間點(diǎn)各組家兔腦脊液中β-EP含量對(duì)比 mg·L-1,±s

表2 各時(shí)間點(diǎn)各組家兔腦脊液中β-EP含量對(duì)比 mg·L-1,±s

注:與0 h正常組對(duì)比,**P＜0.01;與0 h模型組對(duì)比,#P＜0.05,##P＜0.01;與捻轉(zhuǎn)組相同時(shí)間點(diǎn)對(duì)比,△P＜0.05,△△P＜0.01。

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2.3 熱補(bǔ)針法對(duì)家兔腦脊液中CCK-8含量的影響

模型組腦脊液中CCK-8含量顯著低于正常組(P＜0.01);與0 h模型組對(duì)比,捻針組和熱補(bǔ)組各時(shí)刻CCK-8含量有顯著回升(P＜0.01或P＜ 0.05),但均顯著低于正常組(P＜0.01);熱補(bǔ)組即時(shí)、0.5 h CCK-8含量與模型組對(duì)比差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),而熱補(bǔ)組1 h、2 h CCK-8含量顯著高于捻轉(zhuǎn)組(P＜0.05,P＜0.01)。見表3。

表3 各時(shí)間點(diǎn)各組家兔腦脊液中CCK-8含量對(duì)比 mg·L-1,±s

表3 各時(shí)間點(diǎn)各組家兔腦脊液中CCK-8含量對(duì)比 mg·L-1,±s

注:與0 h正常組對(duì)比,**P＜0.01;與0 h模型組對(duì)比,#P＜0.05,##P＜0.01;與捻轉(zhuǎn)組相同時(shí)間點(diǎn)對(duì)比,△P＜0.05,△△P＜0.01。

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3 討 論

痛閾是目前被廣泛采用以判斷鎮(zhèn)痛效果的指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示,經(jīng)針刺治療后,捻轉(zhuǎn)組和熱補(bǔ)組各時(shí)刻關(guān)節(jié)局部痛閾均顯著高于模型組,提示捻轉(zhuǎn)針法和熱補(bǔ)針法的鎮(zhèn)痛效應(yīng)均至少持續(xù) 2 h以上,這與某些報(bào)道[5]不一致。熱補(bǔ)針法的即時(shí)鎮(zhèn)痛效應(yīng)與捻轉(zhuǎn)針法對(duì)比差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),但熱補(bǔ)組針后0.5 h、1 h、2 h的痛閾顯著高于捻轉(zhuǎn)組(P＜0.01或P＜0.05),說明熱補(bǔ)針法的鎮(zhèn)痛后效應(yīng)優(yōu)于捻轉(zhuǎn)針法。

針刺鎮(zhèn)痛的原理是多方面的,無論用手捻針或電針,其中激活中樞內(nèi)源性阿片肽(EOP)的釋放起著關(guān)鍵性的作用[6-7]。β-EP為內(nèi)啡肽家族成員之一,研究證明針刺通過促進(jìn)中樞和外周 β-EP的釋放參與了針刺鎮(zhèn)痛過程[2,8]。本實(shí)驗(yàn)證實(shí),經(jīng)過治療后兩治療組即時(shí)痛閾在升高的同時(shí),腦脊液中β-EP含量均有上升,而且熱補(bǔ)組0.5 h、1 h、2 hβ-EP含量顯著高于捻轉(zhuǎn)組,與痛閾的變化呈正相關(guān),提示腦脊液中β-EP不但參與針刺鎮(zhèn)痛,而且與熱補(bǔ)針法和捻轉(zhuǎn)針法鎮(zhèn)痛后效應(yīng)有差異相關(guān)聯(lián)。

針刺引起阿片肽釋放的同時(shí)也引起中樞抗阿片肽的釋放,中樞神經(jīng)系統(tǒng)中阿片和抗阿片的相互作用是決定針刺鎮(zhèn)痛效果優(yōu)劣的決定性因素之一[9]。CCK-8是目前已知的作用最強(qiáng)的內(nèi)源性抗阿片肽,是中樞抗阿片鎮(zhèn)痛的物質(zhì)之一。研究[10-11]表明:加強(qiáng)腦內(nèi)CCK基因表達(dá),可以降低針刺鎮(zhèn)痛效果;抑制其基因表達(dá),則可提高針刺效應(yīng)。在本實(shí)驗(yàn)條件下,經(jīng)過治療后兩治療組即時(shí) CCK-8含量均有回升,熱補(bǔ)組1 h、2 h CCK-8含量顯著高于捻轉(zhuǎn)組,與痛閾和 β-EP的變化趨勢(shì)相同,說明針刺可促使CCK-8在中樞的釋放向正常水平恢復(fù),而且CSF中CCK-8與形成熱補(bǔ)針法和捻轉(zhuǎn)針法不同鎮(zhèn)痛后效應(yīng)有關(guān)。

總之,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,熱補(bǔ)針法有非常顯著的鎮(zhèn)痛后效應(yīng),熱補(bǔ)針法鎮(zhèn)痛后效應(yīng)優(yōu)于捻轉(zhuǎn)針法,腦脊液中β-EP和CCK-8含量變化與兩種針法鎮(zhèn)痛后效應(yīng)不同有明顯相關(guān)趨勢(shì)。

[1]杜小正,秦曉光,趙彬元,等.傳統(tǒng)“熱補(bǔ)”針法對(duì)實(shí)驗(yàn)性關(guān)節(jié)炎兔的鎮(zhèn)痛效應(yīng)及腦脊液中β-EP、CCK-8含量的影響[J].針刺研究,2006,31(2):86-89.

[2]杜小正,秦曉光,方曉麗.熱補(bǔ)針法鎮(zhèn)痛后效應(yīng)及其對(duì)關(guān)節(jié)局部組織β-內(nèi)啡肽和前列腺素 E2的影響[J].針刺研究,2009,34(5):319-323.

[3]Tominaga K,Alstergren P,Kurita H,et al.Clinical course of an antigen-induced arthritis model in the rabbit temporomandibular joint[J].Oral Pathol Med,1999,28:268-273.

[4]藍(lán)敏,沈慶旗,王巧云.半導(dǎo)體激光對(duì)兔骨折后痛閾的影響[J].江蘇大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版,2003,13(2):160-162.

[5]梁繁榮,羅榮,劉雨星,等.電針鎮(zhèn)痛后效應(yīng)與炎癥局部5-HT、NE、DA含量關(guān)系的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志,2001,7(11):52-55.

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[9]韓濟(jì)生.中樞阿片肽和膽囊收縮素功能活動(dòng)的消長是決定針刺鎮(zhèn)痛有效性的重要因素[J].北京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 1996,28(5):321.

[10]Tang NM,Dong HW,Wang XM,et al.Cholecystokinin antisense RNA increases the analgesic effect induced by electroacupuncture or low dosemorphine:conversion of low responder rats into high responders[J].Pain,1997,71 (1):71-80.

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