王家佳 綜述 魏春生 審校

聲帶特有的精細結(jié)構(gòu)及功能是發(fā)聲的基礎(chǔ)，其中組織學(xué)上又以聲帶固有層細胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)最受關(guān)注。當(dāng)聲帶損傷至一定程度后，細胞外基質(zhì)的組成及分布發(fā)生變化，纖維組織增生，產(chǎn)生不可逆瘢痕，可引起發(fā)聲甚至呼吸障礙。如何復(fù)原細胞外基質(zhì)，是聲帶損傷修復(fù)的關(guān)鍵及難點。近二十年來，組織工程的興起為聲帶損傷的理想修復(fù)與功能重建帶來了希望。本文就聲帶瘢痕的形成機制及治療進展進行綜述。

1 聲帶的解剖及生理

聲帶固有層是介于聲帶上皮層與聲帶肌之間的結(jié)締組織，是與聲帶振動密切相關(guān)的最重要的特征性結(jié)構(gòu)，主要由細胞及細胞外基質(zhì)組成。其細胞成分包括：成纖維細胞、肌成纖維細胞和巨噬細胞。成纖維細胞調(diào)控細胞間質(zhì)的沉著、降解及重新分布，維持固有層結(jié)構(gòu)與功能。肌成纖維細胞是一種特殊分化并具有修復(fù)作用的成纖維細胞，當(dāng)損傷與修復(fù)存在時，這些細胞出現(xiàn)并增加，它們存在于大部分正常聲帶中，淺層最多且活性最高，可能意味著由于長期發(fā)聲，“正常聲帶”亦存在一些微小組織損傷，且損傷主要位于固有層淺層[1]。巨噬細胞的存在是固有層淺層對黏膜刺激的反應(yīng)，其作用是抵御經(jīng)上皮而來的細菌、病毒或有毒物質(zhì)等[1]。根據(jù)分子類型，聲帶固有層細胞外基質(zhì)成分可分為：纖維蛋白、間隙蛋白及其它分子如碳水化合物、脂質(zhì)等。纖維蛋白包括彈性纖維和膠原纖維，其中彈性纖維賦予組織彈性，與聲帶變形和回復(fù)等聲帶振動特性相關(guān)，固有層各層均存在彈力組織；膠原纖維為組織提供結(jié)構(gòu)和力量，受力時可承受壓力、抵抗變形。間隙蛋白圍繞在彈性成分周圍，包括蛋白聚糖和糖蛋白。各種纖維蛋白的含量在固有層各層并不相同，淺層由少量彈性纖維及膠原纖維組成；中間層含有成熟的彈性纖維、纖維調(diào)節(jié)蛋白和高濃度的透明質(zhì)酸(hyaluronic acid，HA)[2～4]；深層含有成熟的膠原纖維，包括Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型膠原纖維[2～6]，此外還有高濃度的粘蛋白多聚糖、二聚糖和基底膜蛋白聚糖等[7]。Catten等[8]對間隙蛋白進行研究后認為，糖蛋白特別是HA對聲帶生物力學(xué)具有重要作用，HA濃度越高則聲帶粘性越高，振動緩沖能力越強。Chan等[9]發(fā)現(xiàn)相比于特氟龍、明膠海綿、膠原和脂肪等移植材料，0.5%～1%的 HA彈性剪切系數(shù)和動態(tài)粘滯度與人體聲帶黏膜相接近，提示HA對聲帶黏膜和固有層缺失修復(fù)具有潛在的應(yīng)用價值。

2 聲帶的損傷及瘢痕形成

2.1聲帶損傷的原因及病理變化 聲帶損傷的原因很多，如用聲過度、插管、咽喉返流、化學(xué)刺激以及各種特異性或非特異性感染等。慢性損傷因子的長期作用可以引起聲帶組織的反應(yīng)提高，導(dǎo)致基底膜結(jié)構(gòu)中斷或者增厚、血管變化、細胞外基質(zhì)成份改變等，其中慢性損傷可引起聲帶息肉、小結(jié)、囊腫及其他一系列能引起聲帶淺層改變的病理變化。此外，醫(yī)源性損傷，主要包括聲帶手術(shù)累及聲韌帶甚至聲帶肌，術(shù)后將導(dǎo)致瘢痕形成。

2.2聲帶損傷的應(yīng)答及瘢痕形成機制 Stedman醫(yī)學(xué)將瘢痕定義為由于損傷或疾病，正常組織被纖維組織替代[10]。聲帶上皮損傷后，表淺性潰瘍形成，沉積的纖維素中充滿巨噬細胞及漿細胞等急慢性炎癥細胞。如果潰瘍小且表淺，僅局限于上皮層，則潰瘍一期愈合；如果損傷較大，傷口收縮，成纖維細胞及膠原沉積于上皮下，形成二期愈合[11]?；趽p傷修復(fù)的自然動態(tài)過程，將組織對損傷的應(yīng)答分為急性、亞急性和慢性三個階段。在鼠聲帶急性損傷的模型中發(fā)現(xiàn)，幾乎損傷后立即就會出現(xiàn)炎癥反應(yīng)(4～8 h)，IL-1、NF-κb和TNF-α升高[12]。在兔聲帶損傷模型中發(fā)現(xiàn)，損傷后3天可見廣泛的細胞浸潤，5天后可見上皮再生[13]。此外，基質(zhì)成分也與對照側(cè)有著廣泛的區(qū)別，如HA明顯下降，膠原纖維和纖維連接蛋白升高[13～16]。在亞急性期，損傷側(cè)纖維連接蛋白沉積增多[17,18]，彈性纖維減少[19,20]，膠原含量變化報道不一：有報道Ⅰ、Ⅲ型膠原含量增加[16]；有報道Ⅰ型前膠原增加而Ⅰ型膠原含量不變[20]；另有報道Ⅰ型膠原含量下降[19]，不同的結(jié)果可能與使用不同的動物模型有關(guān)。利用犬和兔模型研究聲帶損傷后6個月的應(yīng)答反應(yīng)發(fā)現(xiàn)，損傷側(cè)膠原沉積增多且排列紊亂，HA水平無明顯改變，彈性蛋白含量在犬模型中明顯減少，聲帶彈性剪切系數(shù)和動態(tài)粘滯度增加[20,21]。

聲帶損傷的預(yù)后與損傷程度直接相關(guān)。黏膜層包括上皮層和固有層淺層的損傷，愈合后不留瘢痕，固有層淺層的基質(zhì)中含有許多抗瘢痕形成的物質(zhì)，如HA、核心蛋白聚糖和纖維蛋白。HA可以抑制成纖維細胞合成膠原及膠原沉積，核心蛋白聚糖和纖維蛋白可以阻止膠原的形成和原纖維的生成[22]。而固有層中間層以下即聲韌帶甚至聲帶肌受損，愈合過程中纖維組織廣泛增生，排列紊亂，將產(chǎn)生不可逆的瘢痕，導(dǎo)致聲帶黏膜波減弱或缺失及聲門閉合不全，成為影響發(fā)聲的兩個關(guān)鍵因素。

3 聲帶瘢痕的治療

3.1嗓音訓(xùn)練 美國耳鼻喉科學(xué)會在處理聲嘶的臨床實踐指南中，將嗓音訓(xùn)練定位為有效的一線或聯(lián)合治療聲帶瘢痕的方法之一。其內(nèi)容主要包括：① 衛(wèi)生用嗓：如減少濫用和誤用，減少不當(dāng)?shù)那迳ば袨榈?；②針對不適當(dāng)?shù)囊粽{(diào)、響度、音質(zhì)等癥狀控制；③協(xié)調(diào)呼吸、發(fā)聲、共鳴行為[23]。盡管這些方法不能從組織學(xué)上逆轉(zhuǎn)聲帶瘢痕，但持之以恒的嗓音訓(xùn)練能使聲帶瘢痕患者的發(fā)聲功能得以改善。

3.2手術(shù)治療 迄今，臨床上治療聲帶瘢痕的術(shù)式主要包括聲帶注射填充術(shù)和內(nèi)移性喉成形術(shù)。聲帶注射填充術(shù)是根據(jù)聲帶瘢痕的不同部位和程度，將自體或異體填充材料注射或填充至聲帶不同層次或聲門旁間隙，使聲帶體積增加、游離緣內(nèi)移，以改善聲門閉合狀況及聲帶振動特性，改善發(fā)聲及吞咽功能[24]。選擇合適的植入物需要考慮很多因素，包括植入物的易獲得性、生物相容性、穩(wěn)定和吸收性等，目前臨床常用的注射材料包括自體脂肪、膠原、筋膜等。隨著對聲帶結(jié)構(gòu)的深入認識和生物合成技術(shù)的應(yīng)用，透明質(zhì)酸、羥基磷灰石等與固有層細胞外基質(zhì)成分和黏彈性相近的物質(zhì)也應(yīng)用于臨床，并有望恢復(fù)聲帶的層狀結(jié)構(gòu)和振動功能。內(nèi)移性喉成形術(shù)包括原I型甲狀軟骨成形和杓狀軟骨內(nèi)收術(shù)，與聲帶注射填充術(shù)相比，對部分聲門尤其后段縫隙過大或雙側(cè)聲帶位置不一致者更具適用性。

聲帶瘢痕患者經(jīng)聲帶注射填充術(shù)或內(nèi)移性喉成形術(shù)后，發(fā)聲費力等癥狀得以改善，但兩種術(shù)式主要為減少或消滅由瘢痕所導(dǎo)致的聲門閉合不全，而非針對瘢痕本身，聲帶振動的關(guān)鍵因素——黏膜波并未恢復(fù)，因此術(shù)后嗓音質(zhì)量提高有限。

3.3組織工程學(xué) 如何從根本上針對聲帶瘢痕本身治療，組織工程學(xué)是近年來的研究熱點，其基本要素包括種子細胞、支架材料和調(diào)節(jié)因子，目的是阻止聲帶損傷愈合過程中瘢痕的形成，保護或恢復(fù)細胞外基質(zhì)成分和分布，恢復(fù)聲帶正常的振動特性和發(fā)聲功能。

最常應(yīng)用的種子細胞為干細胞，包括胚胎干細胞和成體干細胞。Kanemaru[25]、Lee等[26]在犬聲帶損傷模型上進行自體骨髓間充質(zhì)干細胞和自體脂肪間充質(zhì)干細胞聲帶注射的研究，結(jié)果顯示聲帶外形基本恢復(fù)正常，受損部位未出現(xiàn)瘢痕。Hertegard等[27]在兔聲帶損傷模型上進行了聲帶注射人骨髓間充質(zhì)干細胞，結(jié)果顯示注入受損聲帶后的干細胞能夠持續(xù)存在，再生的細胞外基質(zhì)組織結(jié)構(gòu)與正常聲帶相似，聲帶的黏彈性也接近正常。Cedervall等[28]將人胚胎干細胞應(yīng)用于兔受損聲帶，發(fā)現(xiàn)局部注射胚胎干細胞后，聲帶的黏彈性有很大程度的改善，并發(fā)現(xiàn)植入細胞的分化外形類似軟骨細胞、肌細胞和上皮細胞。除干細胞外，成纖維細胞亦被作為種子細胞促進損傷聲帶的再生，Chhetri等[29]在狗聲帶損傷模型中將自體成纖維細胞注入單側(cè)全層損傷的聲帶固有層中，動態(tài)喉鏡檢查發(fā)現(xiàn)，聲帶的振動和發(fā)聲功能在損傷后8周下降，29周后恢復(fù)正常；組織學(xué)檢查示成纖維細胞和膠原增多，而彈性蛋白減少，HA含量無明顯改變。Krishna等[30]將經(jīng)肝細胞生長因子預(yù)處理的成纖維細胞應(yīng)用于兔聲帶損傷模型，發(fā)現(xiàn)其能夠有效促進受損聲帶透明質(zhì)酸的分泌，并能夠減少膠原的產(chǎn)生，對預(yù)防聲帶瘢痕的形成具有積極作用。聲帶固有層的細胞外基質(zhì)是細胞成分的天然支架，在聲帶組織工程的研究中，細胞外基質(zhì)成分的體外培養(yǎng)和注射后觀察是研究的重點之一。Finck等[31]在顯微鏡下進行人受損聲帶任克層的酯化透明質(zhì)酸注射，術(shù)后喉鏡檢查顯示聲帶對其耐受性好，外觀基本恢復(fù)正常，嗓音改善。Hahn等[32]將膠原和水凝膠復(fù)合物注射到豬損傷聲帶的固有層，結(jié)果顯示其能夠有效促進受損聲帶彈性纖維和成纖維細胞的增長，并能減少基質(zhì)的壓縮和吸收等對再生不利的因素。Duflo等[33]應(yīng)用透明質(zhì)酸和硫醇鹽凝膠的混合物加上多聚二元醇形成的復(fù)合物作為支架，將其移植入兔損傷聲帶中，觀察其促進兔損傷聲帶固有層的再生，結(jié)果顯示再生組織的黏彈性得到較大改善。

在聲帶組織工程調(diào)節(jié)因子的研究中，肝細胞生長因子的研究較多，其具有促進胚胎發(fā)育、血管生長和組織再生的作用，參與合成成纖維細胞、上皮細胞和內(nèi)皮細胞，并有抗纖維化的能力。Hirano等[34]研究采用肝細胞生長因子在體外調(diào)控犬和人聲帶成纖維細胞生成細胞外基質(zhì)，結(jié)果顯示成纖維細胞分泌的透明質(zhì)酸含量增高，I型膠原含量減少，纖維連接蛋白含量基本不變，這將有助于抑制纖維的沉積及肉芽組織的形成。此后，他們[35]又將肝細胞生長因子用于促進兔損傷聲帶的修復(fù)再生，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其能夠防止損傷聲帶膠原的過度沉積，并促進透明質(zhì)酸及彈性蛋白的合成，聲門閉合情況和聲帶黏膜波也得到改善，受損聲帶再生的固有層組織具有與正常聲帶類似的組織學(xué)特性、黏彈性及振動特性。Ohno等[36]制作了肝細胞生長因子與凝膠的復(fù)合物，在聲帶損傷后1個月行局部注射，觀察6個月后，發(fā)現(xiàn)修復(fù)后的聲帶振動情況良好并抑制了膠原的沉積，促進了透明質(zhì)酸和彈性蛋白的分泌，認為將細胞因子與支架材料結(jié)合是促進聲帶修復(fù)再生的方法之一。

應(yīng)用組織工程學(xué)預(yù)防和修復(fù)聲帶瘢痕是目前研究的熱點之一，也是希望所在，但使聲帶瘢痕從形態(tài)學(xué)、組織學(xué)及功能學(xué)上完全恢復(fù)正常，尤其是應(yīng)用于臨床，目前尚未實現(xiàn)，有待細胞生物學(xué)、移植免疫學(xué)、生物材料學(xué)等多學(xué)科的發(fā)展及干細胞基礎(chǔ)理論的突破。

4 參考文獻

1 Catten M, Gray SD, Hammond TH, et al. Analysis of cellular location and concentration in vocal fold lamina propria[J]. Otolaryngol Head Neck Surg, 1998, 118: 663.

2 Hahn MS, Kobler JB, Starcher BC, et al. Quantitative and comparative studies of the vocal fold extracellular matrix - I: Elastic fibers and hyaluronic acid[J]. Ann Otol Rhinol Laryngol, 2006, 115: 156.

3 Hammond TH, Zhou RX, Hammond EH, et al. The intermediate layer: A morphologic study of the elastin and hyaluronic acid constituents of normal human vocal folds[J]. J Voice, 1997, 11: 59.

4 Pawlak AS, Hammond T, Hammond E, et al. Immunocytochemical study of proteoglycans in vocal folds[J]. Ann Otol Rhinol Laryngol, 1996, 105: 6.

5 Hahn MS, Kobler JB, Zeitels SM, et al. Midmembranous vocal fold lamina propria proteoglycans across selected species[J]. Ann Otol Rhinol Laryngol, 2005, 114: 451.

6 Hahn MS, Kobler JB, Zeitels SM, et al. Quantitative and comparative studies of the vocal fold extracellular matrix II: Collagen[J]. Ann Otol Rhinol Laryngol, 2006, 115: 225.

7 Hahn MS, Jao CY, Faquin W, et al. Glycosaminoglycan composition of the vocal fold lamina propria in relation to function[J]. Ann Otol Rhinol Laryngol, 2008, 117: 371.

8 Catten M, Gray SD, Hammond TH, et al. Analysis of cellular location and concentration in vocal fold lamina propria[J]. Otolaryngol Head Neck Surg, 1998，118: 663.

9 Chan RW, Titze IR.Hyaluronic acid (with fibronectin ) as bioimplant for the vocal fold mucosa[J]. Laryngoscope, 1999, 109: 1 142.

10 Spraycar M. Stedman's medical dictionary[M].26th ed. Baltimore:Williams and Wilkins, 1995.1 576～1 576.

11 Benninger MS, Alessi D, Archer S, et al. Vocal fold scarring: Current concepts and management[J]. Otolaryngol Head Neck Surg, 1996,115: 474.

12 Lim XH, Tateya L, Tateya T, et al. Immediate inflammatory response and scar formation in wounded vocal folds[J]. Ann Otol Rhinol Laryngol, 2006, 115: 921.

13 Branski RC, Rosen CA, Verdolini K, et al. Acute vocal fold wound healing in a rabbit model[J]. Ann Otol Rhinol Laryngol, 2005, 114: 19.

14 Thibeault SL, Rousseau B, Welham NV, et al. Hyaluronan levels in acute vocal fold scar[J]. Laryngoscope, 2004, 114: 760.

15 Rousseau B, Sohn J, Tateya I, et al. Functional outcomes of reduced hyaluronan in acute vocal fold scar[J]. Ann Otol Rhinol Laryngol, 2004, 113: 767.

16 Tateya T, Tateya I, Sohn JH, et al. Histologic characterization of rat vocal fold scarring[J]. Ann Otol Rhinol Laryngol, 2005, 114: 183.

17 Hirano S, Bless DM, Rousseau B, et al. Fibronectin and adhesion molecules on canine scarred vocal folds[J]. Laryngoscope, 2003, 113: 966.

18 Thibeault SL, Bless DM, Gray SD. Interstitial protein alterations in rabbit vocal fold with scar[J]. J Voice, 2003, 17: 377.

19 Thibeault SL, Gray SD, Bless DM, et al. Histologic and rheologic characterization of vocal fold scarring[J]. J Voice, 2002, 16: 96.

20 Rousseau B, Hirano S, Scheidt TD, et al. Characterization of vocal fold scarring in a canine model[J]. Laryngoscope, 2003, 113: 620.

21 Rousseau B, Hirano S, Chan RW, et al. Characterization of chronic vocal fold scarring in a rabbit model[J]. J Voice, 2004, 18: 116.

22 Hedlund H, Mengarelli-Widholm S, Heinegard D, et al. Fibromodulin distribution and association with collagen[J]. Matrix Biol, 1994, 14: 227.

23 Seth R, Seth H, Ellen S, et al. Clinical pratice guideline: Hoarseness(Dysphonia) [J]. Otolaryngol Head Neck Surg, 2009, 141: 1.

24 胡慧英, 徐文. 聲帶注射填充術(shù)[J]. 國際耳鼻咽喉頭頸外科雜志, 2006, 30: 296.

25 Kanemaru SI, Nakamura T, Omori K, et al. Regeneration of the vocal fold using autologous mesenchymal stem cells[J]. Ann Otol Rhinol Laryngol, 2003, 112: 915.

26 Lee BJ, Wang SG, Lee JC, et al. The prevention of vocal fold scaring using autologous adipose tissue-derived stromal cells[J]. Cells Tissues Organs, 2006, 184: 198.

27 Hertegard S, Cedervall J, Svensson B, et al. Viscoelastic and histologic properities in scarred rabbit vocal folds after mesenchymal stem cell injection[J]. Laryngoscope, 2006, 116:1 248.

28 Cedervall J, Ahrlund-Richter L, Svensson B, et al. Injection of embryonic stem cells into scarred rabbit vocal folds enhances healing and improves viscoelasticity: Short-term results[J]. Laryngoscope, 2007, 117: 2 075.

29 Chhetri DK, Head C, Revazova E, et al. Lamina propria replacement therapy with cultured autologous fibroblasts for vocal fold scars[J]. Otolaryneal Head Neck Surg , 2004, 131: 864.

30 Krishna P, Rosen CA, Branski RC, et al. Primed fibroblasts and exogenous decorin: Potential treatments for subacute vocal fold scar[J]. Otolaryngol Head Neck Surg, 2006, 135: 937.

31 Finck C, Lefebvre P. Implantation of esterified hyaluronic acid in microdissected Reinke's space after vocal fold microsurgery: First clinical experiences[J]. Laryngoscope, 2005, 115: 1 841.

32 Hahn MS, Ttply BA, Stevens MM, et al. Collagen composite hydrogels for vocal fold lamina propria restoration[J]. Biomaterials, 2006, 27: 1 104.

33 Duflo S, Thibeault SL, Li W, et al. Vocal fold tissue repair in vivo using a synthetic extracellular matrix[J]. Tissue Eng, 2006, 12: 2 171.

34 Hirano S, Bless D, Heisey D, et al. Roles of hepatocyte growth factor and transforming growth factor betal in production of extracellular matrix by canine vocal fold fibroblasts[J]. Laryngoscope, 2003, 113: 144.

35 Hirano S, Bless D, Rousseau B,et al. Prevention of vocal fold scarring by topical injection of hepatocyte growth factor in a rabbit model[J]. Laryngoscope, 2004, 114: 548.

36 Ohno T, Hirano S, Kanemaru SI, et al. Drug delivery system of hepatocyte growth factor for the treatment of vocal fold scarring in a canine model[J]. Ann Otol Rhinol Laryngol, 2007, 116: 762.