張 巖,馬麗娜,陶遵威

(1.天津中醫(yī)藥大學(xué),天津 300073； 2.天津市醫(yī)藥科學(xué)研究所,天津 300020)

多糖(polysaccharides,PS),是一類天然高分子化合物,是由醛糖或酮糖通過苷鏈連接在一起的聚合度超過10的多聚物,在生物體內(nèi)作為能量物質(zhì),存在于一切細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)中,參與細(xì)胞的各種生理活動(dòng),是維持生命活動(dòng)正常運(yùn)轉(zhuǎn)的基本物質(zhì)之一。多糖也是中藥活性成分之一,具有許多藥理活性和藥效功能[1-3],在免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗凝血、降血糖、降血脂、抗輻射、抗菌、抗感染、抗病毒、保護(hù)肝臟和抗衰老等方面具有獨(dú)特的功效,而且多糖來源廣泛且無毒,具有較高的開發(fā)價(jià)值。因此,對(duì)中藥多糖的研究開發(fā),越來越引起國內(nèi)外科研工作者的興趣,并成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。在我國,中藥多糖研究近幾年發(fā)展得非常迅速,但多糖的分離純化以及分析方法基于效率和成本等多方面的考慮,尚無公認(rèn)、有效、統(tǒng)一的模式,運(yùn)用各種分離純化方法對(duì)不同植物多糖的開發(fā)、比較和分析,仍是研究工作的焦點(diǎn)之一。因此,本文就近年來有關(guān)中藥多糖的分離純化方法做一概述,以期為多糖的相關(guān)研究及進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考。

1 多糖的分離純化

從中草藥中提取的粗多糖,一般含有許多雜質(zhì),主要有無機(jī)鹽、單糖、寡糖、低分子量的非極性物質(zhì)及高分子量的有機(jī)雜質(zhì)，需進(jìn)一步除去雜質(zhì)、分離并進(jìn)行精制,方可進(jìn)行下一步的研究。通常的步驟是先將極性差異較大的組分進(jìn)行分離；再經(jīng)過除蛋白、脫色等處理；然后進(jìn)一步將多糖按不同相對(duì)分子質(zhì)量進(jìn)行分級(jí)。具體的方法根據(jù)中草藥的性質(zhì)不同而異。

1.1超濾膜分離法 超濾(UF)是一種膜分離技術(shù),所采用的超濾膜能夠從水和其他液體中分離出很小的膠體和大分子。將超濾膜用于多糖這種生物活性物質(zhì)的分離,具有不損害活性、分離效率高、能耗低、設(shè)備簡單、可連續(xù)生產(chǎn)、無污染等優(yōu)點(diǎn),在多糖分離方面具有廣闊的應(yīng)用前景[4,5]。李燕妮[6]探索了超濾法分離純化刺參酸性黏多糖的工藝。確定分離純化條件為:采用截留分子量8 kDa的超濾膜,壓力為0.3 MPa,溫度為10℃。此工藝制得多糖純度為93.4%,收率為0.32%,多糖截留率達(dá)到97.2%。王子堯等[7]采用切向流超濾技術(shù)分離丹皮多糖的截留率達(dá)到92.91%,多糖制品的純度達(dá)到84.2%,說明超濾是分離濃縮丹皮多糖的有效手段之一。Marnoch R 等[8]還應(yīng)用超濾法純化了芥子蛋白。

1.2沉淀分離法 包括分步沉淀法和季銨鹽沉淀法。分步沉淀法根據(jù)多糖在不同濃度的低級(jí)醇或酮中具有不同溶解度的性質(zhì),逐次按比例由小到大加入這些醇或酮(常用的是甲醇、乙醇和丙酮)將不同相對(duì)分子質(zhì)量的多糖分別沉淀出來[9]。這種方法適宜于分離各種溶解度相差較大的多糖。閆巧娟等[10]用不同濃度乙醇沉淀黃芪水提液的方法獲得了黃芪多糖的不同相對(duì)分子質(zhì)量分布情況。此方法可結(jié)合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)用于考查不同相對(duì)分子質(zhì)量多糖的生物活性。季銨鹽沉淀法根據(jù)長鏈季銨鹽能與酸性多糖成鹽,形成水不溶性多糖化合物的特性,常用于酸性多糖的分離。當(dāng)溶液的pH值增高或加入硼砂緩沖液使糖的酸度增高,也會(huì)與中性多糖形成沉淀。常用的季銨鹽是十六烷基三甲基銨溴化物(CTAB)及其堿(CTA-OH)和十六烷基呲啶(CPC),其濃度一般為 1%～10%(W/V),其可在酸性、中性、微堿性或堿性中分級(jí)沉淀分離出酸性多糖[11]。陳海華等[12]采用CTAB絡(luò)合法分離得到酸性多糖(AFM)和中性多糖(NFM)粗制品。李宏燕等[13]經(jīng)正交試驗(yàn)優(yōu)選出大棗多糖純化工藝體積比為1∶1加入2%(W/V)的 CTAB，35℃下保溫靜置4h。

1.3柱色譜法 根據(jù)柱填料的不同,柱色譜法既可用于多糖與其他極性差異較大組分的分離,也可用于多糖的脫色與分級(jí)。常用的柱層析方法有凝膠柱層析、陰離子交換柱層析和大孔樹脂柱層析。

1.3.1凝膠柱層析法 凝膠色譜利用分子篩原理,根據(jù)被分離物質(zhì)分子的大小和形狀不同而達(dá)到分離目的。常用的凝膠有葡聚糖凝膠(sephadex)和瓊脂糖凝膠(sepharose),以不同濃度的鹽溶液和緩沖溶液作為洗脫劑,使各種多糖得以分離純化,但不適宜黏多糖的分離。張?bào)w祥等[14]用Sephadex G-100凝膠柱層析對(duì)板藍(lán)根多糖進(jìn)行分離,得到一種分子量均一的ISP 2多糖。洪閣等[15]用Sephadex G-200分離純化得到了銀耳堿多糖的均一組分TFBP-A 。高義霞等[16]將經(jīng)脫蛋白、脫色后的沙蒿多糖用 ultrahydrogel TM 500層析分離純化,0.1 mol/L磷酸緩沖液洗脫,在凝膠色譜中出現(xiàn)單一而對(duì)稱的峰,純化效果好、純度高。凝膠柱層析是目前植物多糖最常用的高級(jí)純化方法。

1.3.2陰離子交換柱層析法 陰離子交換柱層析適合于分離各種酸性、中性多糖和黏多糖。常用的交換介質(zhì)有DEAE-纖維素、DEAE-葡萄糖凝膠、DEAE-瓊脂糖凝膠,最常用的陰離子交換柱層析填料是DEAE-纖維素,既可純化多糖,還可分離各種多糖。洗脫劑可用不同濃度的堿溶液、硼砂溶液和鹽溶液等。在pH值為6時(shí)，酸性多糖能吸附于交換劑上,中性多糖不吸附。然后用pH值相同，但離子強(qiáng)度不同的緩沖液將酸性強(qiáng)弱不同的酸性多糖分別洗脫下來。但如果柱為堿性,則中性多糖也能吸附,吸附力一般隨多糖分子中酸性基團(tuán)的增加而增加。羅婭君等[17]采用DEAE-纖維素柱層析從大葉金花草粗多糖中分離出中性多糖和酸性多糖。該方法主要用于多糖的初級(jí)純化。吳彥[18]將實(shí)驗(yàn)得到的大薊粗多糖用DEAE-纖維素離子交換柱層析進(jìn)一步分離純化,通過蒸餾水和NaCl溶液梯度洗脫,再通過透析、濃縮和冷凍干燥得到DJ1,DJ2,DJ3,DJ4和DJ5 5個(gè)次級(jí)組分。其中以0.4 mol/L NaCl溶液洗脫出的DJ2組分得率最高,為0.806%。

1.3.3大孔樹脂柱層析法 大孔樹脂分離技術(shù)應(yīng)用于多糖,已有多個(gè)文獻(xiàn)對(duì)其進(jìn)行了描述,主要用于提取液中多糖的純化以及脫色。如朱建飛等[19]用特1號(hào)大孔吸附樹脂對(duì)菜籽多糖水溶液脫進(jìn)行脫蛋白和脫色,其效果良好。陳木森等[20]研究了8種樹脂對(duì)青錢柳多糖的靜態(tài)吸附性能,篩選出一種吸附較好的樹脂,并利用柱層析進(jìn)行青錢柳多糖的純化研究。結(jié)果表明,D301R樹脂對(duì)青錢柳多糖吸附量最大,效果較好。但方積年等[9]認(rèn)為,大孔樹脂吸附適合分離小分子物質(zhì),分離純化多糖易使多糖活性降低,故不宜使用。

1.3.4其他分離純化方法 除常用方法外,還有一些方法用于多糖的分離純化。如制備性區(qū)域電泳法,利用不同質(zhì)荷比多糖在電場作用下遷移速度不同而達(dá)到分離；鹽析法,根據(jù)不同多糖在不同鹽濃度中溶解度不同而達(dá)到分離；金屬絡(luò)合物法,利用多糖能與某些金屬離子(銅、鋇、鈣、鉛等)形成絡(luò)合物沉淀而分離；過氧化氫法與反膠束法也可以對(duì)多糖脫色使其得到純化。此外,結(jié)晶法、酶解法、透析袋法、超速離心法、親和色譜分級(jí)法、制備性高壓液相色譜、活性碳柱色譜法、離心沉淀色譜法、微波輔助及逆流色譜法(CCC)等方法[21-23]也有應(yīng)用,但由于適應(yīng)對(duì)象較少或技術(shù)要求較高而較少使用。

多糖的分離純化，如僅用一種方法難以獲得組分較單純的植物多糖,只有將兩種或多種純化方法有機(jī)地結(jié)合起來,充分利用每種純化方法的優(yōu)勢(shì),才能使多糖組分高效的分離。

2 現(xiàn)狀與展望

多糖的藥理作用廣泛,以獨(dú)特的活性和低毒性的特點(diǎn)使其在臨床應(yīng)用中具有很大的潛力。我國豐富的動(dòng)植物資源為中藥多糖的開發(fā)提供了得天獨(dú)厚的條件,原料成本低廉、資源豐裕,為多糖提取的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用提供了較大的發(fā)展空間。

然而,多糖的研究與蛋白質(zhì)和核酸的研究相比,還有相當(dāng)?shù)牟罹啵@與多糖本身結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜、種類繁多、其分離純化難度大、有些多糖含量低等諸多因素有關(guān),給多糖的研究和應(yīng)用帶來許多的挑戰(zhàn),這還需要廣大科學(xué)工作者的繼續(xù)努力。多糖的分離純化方法在不斷更新,但在選取方法時(shí),應(yīng)當(dāng)關(guān)注目標(biāo)多糖的性質(zhì)和特點(diǎn),綜合比較后進(jìn)行實(shí)驗(yàn),才能選取最佳的方法和工藝。

因此,開展中藥多糖分離純化方法的研究,既可以為擴(kuò)大該類藥物藥源提供了科學(xué)的依據(jù),又可以進(jìn)一步促進(jìn)多糖類藥物的發(fā)展,為開發(fā)出低毒、高活性的多糖類新藥提供理論依據(jù)。

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