李維娜 韓梅芳 寧 琴

機(jī)體的天然免疫是病原體相關(guān)分子模式（Pathogen-associated molecular patterns，PAMP） 識(shí)別入侵的病原微生物（如病毒）并釋放細(xì)胞因子（如Ⅰ型干擾素），從而誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗病毒免疫反應(yīng)。腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子相關(guān) NF-κB激活子（TANK）結(jié)合激酶 1（TBK1）[1-3]是天然免疫中重要的激酶，從NF-κB活性調(diào)節(jié)機(jī)制中鑒定出來(lái)，在抗病毒dsRNA反應(yīng)中于包含Toll/IL-1R同源結(jié)構(gòu)域（TIR）接頭誘導(dǎo)干擾素-（TRIF）和病毒誘導(dǎo)信號(hào)接頭（VISA）的下游被激活。TBK1能在體外磷酸化干擾素調(diào)節(jié)因子（IRF）-3和IRF-7[4-6]，與后者形成同型二聚體或異性二聚體，移位至細(xì)胞核內(nèi)誘導(dǎo)I型干擾素和干擾素誘導(dǎo)基因的表達(dá)。研究證實(shí)，TBK1是 Toll樣受體 3（TLR3） 和 RIG-I樣解螺旋酶（RLH）信號(hào)途徑產(chǎn)生干擾素必不可少的因素[6-9]。盡管宿主抗病毒反應(yīng)是激發(fā)固有免疫反應(yīng)和增強(qiáng)適當(dāng)抗病毒免疫所必需的，但其過(guò)度活化會(huì)對(duì)正常的細(xì)胞產(chǎn)生不利影響。TBK1s是TBK1的一種剪接體，與TBK1相比缺乏外顯子3～6，不含激酶區(qū)域，但仍具有結(jié)合IRF-3的能力。當(dāng)感染Sendai病毒時(shí)，人和小鼠細(xì)胞中TBK1s均有誘導(dǎo)表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)其能干擾RIG-I和VISA之間的相互作用，而其過(guò)表達(dá)能抑制IRF3核移位，進(jìn)而負(fù)性調(diào)節(jié)病毒激發(fā)的干擾素信號(hào)途徑[10]。本實(shí)驗(yàn)研究了TBK1s在丙型肝炎患者PBMC中的表達(dá)情況。

資料與方法

一、一般資料 自2008年6月至2008年7月在我科門(mén)診就診的慢性丙型肝炎患者20例，其中未經(jīng)干擾素/利巴韋林治療患者11例，平均年齡42歲，患者血清抗丙型肝炎病毒抗體陽(yáng)性，平均HCV RNA載量為5.31IU/ml，血清ALT值為58.5IU/L；經(jīng)干擾素/利巴韋林治療慢性丙型肝炎患者9例，平均年齡37歲，抗丙型肝炎病毒抗體陽(yáng)性，HCV RNA陰性，血清ALT均在正常范圍。另選擇健康人9例，平均年齡25歲。

二、RNA提取與cDNA逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增 取肝素抗凝靜脈血10ml，采用淋巴細(xì)胞分離液分離PBMC。加入Trizol 1ml重懸、裂解細(xì)胞，提取RNA，分光光度計(jì)定量，電泳。取 RNA1μg，加入 1μlOligo（dT），雙蒸水補(bǔ)足12μl，70℃水浴 10min，冰上冷卻，4μl逆轉(zhuǎn)錄緩沖液，1μl10mmol/L dNTPs，2μlRNA 酶抑制劑，上述反應(yīng)體系 37℃水浴 5min，加入 1μl逆轉(zhuǎn)錄酶，42℃水浴60min，70℃10min滅活酶，-20保存。

三、Real-time PCR 檢測(cè) TBK1、TBK1s、IFN-β和GAPDH基因選自人類(lèi)基因庫(kù)NCBI，采用primer 5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物，引物（武漢博亞生物科技有限公司合成）序列如下：Tbk1上游：5’-GTGGTGGGTGGAATGAATCAT-3’；下游：5’-ATCACGGTGCACTATACCATTCTC-3’；TBK1s：上游:5’-TTCGTGGAAGACATAAGGTATAAAATAATTA-3’；下游：5’-TGCACCAGAAGGCTTTCCTG-3’；IFN-β：上游：5’-AGTGTCAGAAGCTCCTGTGGC-3’；下游：5’-TGAGGCAGTATTCAAGCCTCC-3’；GAPDH：上游：5’-TGGGCTACACTGAGCACCAG-3’；下游：5’GGGTGTCGCTGTTGAAGTCA-3’。Real-time PCR 反應(yīng)體系為20μl，反應(yīng)順序如下:95℃變性60s，而后以95℃5s、56℃ 10s，72℃ 23s，循環(huán) 40 次。最后 60℃延伸10min，再降溫至40℃維持60s。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS軟件，進(jìn)行t檢驗(yàn)。

結(jié)果

一、RNA完整性分析 獲得的RNA和mRNA質(zhì)量較高，經(jīng)凝膠電泳，總RNA的28S和18S條帶清晰，其A260/A280值大于1.8。擴(kuò)增每個(gè)cDNA樣品中的GAPDH，經(jīng)4%瓊脂糖凝膠電泳后，成像系統(tǒng)下觀察可見(jiàn)60bp的清晰條帶，各組樣本逆轉(zhuǎn)錄的cDNA符合要求。

二、實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果 在未經(jīng)干擾素/利巴韋林治療的慢性丙型肝炎患者PBMC中，TBK1s mRNA水平明顯高于健康對(duì)照組（P＜0.05，圖1）。經(jīng)過(guò)干擾素/利巴韋林治療的HCV RNA陰性患者PBMCTbk1s mRNA 水平明顯下調(diào)（P＜0.05，圖 2），而 HCV 陽(yáng)性或陰性患者PBMC TBK1和IFN-β的表達(dá)無(wú)明顯差異（圖3）。

圖1 慢性丙型肝炎患者和健康人PBMC TBK1s

圖2 慢性丙型肝炎患者與健康對(duì)照PBMC TBK1

圖3 慢性丙型肝炎患者與健康對(duì)照PBMC IFN-βm－

討論

I型IFN能在多重水平對(duì)免疫反應(yīng)產(chǎn)生負(fù)性調(diào)節(jié)。例如，RNA解旋酶蛋白LGP2能夠被病毒誘導(dǎo)產(chǎn)生并發(fā)揮負(fù)性調(diào)節(jié)作用。RNF125是一種E3泛素連接酶，能通過(guò)調(diào)節(jié)RIG-I降解來(lái)負(fù)性調(diào)節(jié)RIG-I誘導(dǎo)的抗病毒信號(hào)[11]，而I型IFN的產(chǎn)生可以通過(guò)TBK1前mRNA選擇性的剪接進(jìn)行負(fù)性調(diào)節(jié)[10]。

選擇性剪接也叫可變剪接，是指從一個(gè)mRNA前體中通過(guò)不同的剪接方式產(chǎn)生不同的mRNA剪接異構(gòu)體的過(guò)程，而最終的蛋白產(chǎn)物會(huì)表現(xiàn)出不同或者是相互拮抗的功能和結(jié)構(gòu)特性，或是在相同的細(xì)胞中由于表達(dá)水平的不同而導(dǎo)致不同的表型。事實(shí)上，選擇性剪接作為一些基因的接頭和轉(zhuǎn)錄因子參與抗病毒反應(yīng)[12～16]。例如，曾有人報(bào)道IRF-5選擇性剪接異構(gòu)體被至少兩個(gè)替換啟動(dòng)子分別調(diào)節(jié)，而IRF-3和IRF-3a轉(zhuǎn)錄本的剪接可能是通過(guò)一種組織特異性模式來(lái)調(diào)節(jié)[12，13]。

我們的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Tbk1s在慢性丙型肝炎患者PBMC中的表達(dá)顯著高于健康對(duì)照人群，而在經(jīng)過(guò)干擾素/利巴韋林治療血清HCVRNA轉(zhuǎn)陰的患者PBMC中，其表達(dá)水平下調(diào)。Tbk1水平在HCV感染時(shí)并未發(fā)生變化，而TBK1s的變化誘導(dǎo)I型IFN的生成，提示TBK1s的表達(dá)與丙型肝炎病毒感染相關(guān)，并可能在HCV感染的調(diào)控機(jī)制中發(fā)揮重要作用，這對(duì)抗病毒治療有潛在的臨床意義。

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