蔣玉鳳 黃 飛 張建軍 劉加群 孫華麗

肝纖維化是多種原因引起的慢性肝損傷所共有的病理學(xué)改變，是細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）合成增多、降解不足而在肝內(nèi)過量沉積的結(jié)果[1]。TGF-β及其信號傳導(dǎo)途徑在肝纖維化發(fā)生機(jī)制中起著關(guān)鍵作用，TGF-β信號誘導(dǎo)結(jié)締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF） 的表達(dá)而促進(jìn)ECM的合成，誘導(dǎo)金屬蛋白酶組織抑制因子-1（tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1）表達(dá)，阻斷基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）對 ECM 的降解[2～4]。RNA 干擾是目前最有效的基因沉默技術(shù)，能特異性抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而下調(diào)相應(yīng)蛋白水平及功能。RNAi靶序列的選擇很關(guān)鍵,所以，RNA干擾實(shí)驗通常需要針對一個基因設(shè)計多個靶序列的小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA），以找到最有效的 siRNA 序列[5，6]。本研究旨在針對CTGF和TIMP-1目的基因分別設(shè)計3條siRNA，通過轉(zhuǎn)染肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cell，HSC）以篩選有效的抑制序列，為進(jìn)一步研究CTGF和TIMP-1在肝纖維化發(fā)生中的作用以及探索肝纖維化的基因治療奠定基礎(chǔ)。

材料與方法

一、細(xì)胞與試劑 大鼠HSC-T6由我院中心實(shí)驗室凍存；新生小牛血清購自杭州四季青公司；RNA抽提試劑TRIZOL購自上海生工公司；CTGF、TIMP-1RNA干擾序列由上海生工公司合成；CTGF、TIMP-1、GAPDH、I型前膠原（Procol-α1）、無關(guān)序列（silence）引物由上海博尚生物技術(shù)有限公司合成；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量PCR試劑盒購自FINNZYMES公司；轉(zhuǎn)染試劑KeyGenTransIII購自凱基生物科技發(fā)展公司；III型前膠原、粘連蛋白、透明質(zhì)酸放射免疫分析試劑盒購自上海海研醫(yī)學(xué)生物技術(shù)有限公司；TGF-β1購自美國Cytokines公司。

二、大鼠CTGF和TIMP-1基因干擾靶位設(shè)計 在NCBI Gen Bank數(shù)據(jù)庫中，在線查詢大鼠CTGF和TIMP-1基因序列。CTGF基因序列的Accession number為 AF120275；TIMP-1基因序列的Accession number為NM-053819。然后，在晶賽公司網(wǎng)站在線設(shè)計RNA干擾靶位，通過計算機(jī)軟件，各選取3段，同時設(shè)計陽性對照（GAPDH/r基因干擾靶位）和陰性對照（無關(guān)干擾序列），見表1。

表1 基因靶序列

三、PCR引物的設(shè)計 ①大鼠CTGF（預(yù)計產(chǎn)物483bp）：上游引物：5’-GCCTCGCCTTGGTGCTCCTCCTCT-3’；下游引物：5’-TGCGGTCCTTGGGCTCATCACAC-3’；②大鼠 TIMP-1（預(yù)計產(chǎn)物 308bp）：上游引物：5’-GCGCCCTTTGCATCTCTGG-3’，下游引物：5’-TCGCTGCGGTTCTGGGACTT-3’；③大鼠看家基因GAPDH（預(yù)計產(chǎn)物 570bp）：上游引物：5’-CATAGACAAGATGGTGAAGG-3’，下游引物：5’-TCCACAGTCTTCTGAGTGGC-3’；④大鼠 Procol-α1（預(yù)計產(chǎn)物409bp）：上游引物：5’-AGCCCCTCAACCCCCAGCCTACTT-3’，下游引物：5’-CCCACCCCACCCCTTCACAGAGAT-3’。

四、dsRNA轉(zhuǎn)染TGF-β1活化的HSC 分組轉(zhuǎn)染已經(jīng)TGF-β1刺激活化的HSC：每組5μg dsRNA分別與490μl無血清無抗生素的低糖DMEM培養(yǎng)液混勻后，再加入10μl轉(zhuǎn)染試劑KeyGenTrans III，最終獲得500μl的轉(zhuǎn)染復(fù)合物，加入細(xì)胞培養(yǎng)液中，37℃、5%CO2孵育、轉(zhuǎn)染細(xì)胞 48h。分組：CTGF-1、CTGF-2、CTGF-3、TIMP-1-1、TIMP-1-2、TIMP-1-3、CTGF-1/TIMP-1-1、CTGF-1/TIMP-1-2、CTGF-1/TIMP-1-3、CTGF-2/TIMP-1-1、CTGF-2/TIMP-1-2、CTGF-2/TIMP-1-3、CTGF-3/TIMP-1-1、CTGF-3/TIMP-1-2、CTGF-3/TIMP-1-3、陰性對照組（no-sense）和空白對照組（不加dsRNA）。每組設(shè)3個復(fù)孔，取均值。

五、HSC總RNA的抽提與逆轉(zhuǎn)錄成cDNA 分別進(jìn)行細(xì)胞裂解和RNA的分離、沉淀、洗脫、再溶解，并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。

六、目的基因相對表達(dá)量的檢測 采用熒光定量 PCR法，反應(yīng)體系如下：DyNAmo YBRGreenMastermi×25μl，上下游引物各 2μl，cDNA 5μl，滅菌水 16μl，總體積 50μl。各反應(yīng)管放入熒光定量PCR儀（iCycler，BIO-RAD），按以下條件擴(kuò)增：94℃，5min→（94℃，30s→60℃，30s→72℃，45s）×40個循環(huán)→72℃，10min。在PCR循環(huán)第2步72℃時收集熒光信號，由計算機(jī)軟件自動分析、計算出Ct值。采用比較閾值法[7]計算待測目的基因的相對表達(dá)量，設(shè)陰性對照目的基因的表達(dá)量為1，則所得比值為實(shí)驗組相對于陰性對照組基因表達(dá)量的倍數(shù)。然后，按照下列公式計算抑制率。

七、肝纖維化指標(biāo)檢測 收集轉(zhuǎn)染48小時后HSC培養(yǎng)上清液，檢測III型前膠原（procollagen type-III，PCIII）、透明質(zhì)酸（hexadecenoic acid，HA）、粘連蛋白（laminin，LN）含量，使用智能放免測量儀（SN-695B）完成定量分析。

結(jié)果

一、RNA干擾對靶基因及其下游產(chǎn)物Procolα1mRNA表達(dá)的影響 見表2。

表2 各干擾組對靶基因和procol-α1mRNA表達(dá)的抑制作用

二、肝纖維化指標(biāo)的變化 見表3。

表3 各干擾組PCIII、HA和LN水平（ng/ml）的變化

討論

TGF-β及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在肝纖維化發(fā)生機(jī)制中起著關(guān)鍵作用[8～10]。CTGF 和 TIMP-1 是 TGF-β 信號通路之下游分子，前者促進(jìn)ECM合成，后者抑制ECM降解，在肝纖維化發(fā)生過程中發(fā)揮協(xié)同促進(jìn)作用。

本實(shí)驗?zāi)康脑谟诓捎冕槍閷?dǎo)HSC活化的關(guān)鍵因子CTGF和TIMP-1的siRNA雙重干擾，阻斷CTGF和TIMP-1的促肝纖維化形成作用，以探討肝纖維化的發(fā)病機(jī)制和防治方法。

我們針對每條目的基因分別設(shè)計了3個siRNA干擾候選靶位，分別轉(zhuǎn)染或不同組合后轉(zhuǎn)染經(jīng)TGF-β1刺激活化的大鼠肝星狀細(xì)胞，結(jié)果顯示每組CTGF-dsRNA可高效抑制CTGF及其下游產(chǎn)物procol-α1的表達(dá)，每組TIMP-1-dsRNA也可高度抑制TIMP-1及其下游產(chǎn)物procol-α1的表達(dá)，但不同的干擾靶位干擾效果有較大差異。CTGF和TIMP-1不同靶位RNA聯(lián)合干擾后，對 CTGFmRNA、TIMP-1mRNA 和 procol-α1mRNA 表達(dá)的抑制效果較單獨(dú)干擾的抑制效果更強(qiáng)，說明聯(lián)合應(yīng)用針對一個基因的多個siRNA，或同時干擾幾個基因，阻斷其生命周期的多個環(huán)節(jié)，能產(chǎn)生協(xié)同作用，并有可能減少由于點(diǎn)突變造成的對iRNA治療的耐受。另外，我們發(fā)現(xiàn)聯(lián)合干擾后，CTGF-3/TIMP-1-3組對CTGFmRNA和TIMP-1mRNA的抑制作用最強(qiáng)，而對procol-α1mRNA的抑制作用最強(qiáng)的卻是CTGF-2/TIMP-1-3組，可能與iRNA抑制的靶基因有關(guān)，尚需以后做進(jìn)一步的研究證實(shí)。肝纖維化指標(biāo)檢測也提示CTGF-3組和TIMP-1-3組單獨(dú)抑制PC III型、HA、LN最佳，而聯(lián)合干擾時，以CTGF-2/TIMP-1-3組對III型膠原、HA、LN的抑制作用最強(qiáng)。

由于機(jī)體的復(fù)雜性，ECM的合成和降解還受到許多因素的影響。因此，應(yīng)進(jìn)一步觀察CTGF和TIMP-1與TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)系，不僅有助于進(jìn)一步闡明CTGF和TIMP-1在肝纖維化發(fā)生中的作用機(jī)制，也可能為肝纖維化的防治研究提供重要的途徑。

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