張彩華 姜妙娜 袁麗君 李寒姝 趙赫男 李 驄 賈玉杰

Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是一條在生物進(jìn)化過程中高度保守的通路，在調(diào)控胚胎發(fā)育以及細(xì)胞的黏附、增殖、分化和凋亡等過程中發(fā)揮重要的作用[1，2]。近年來，Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的異常已成為腫瘤以及其他一些疾病的研究熱點(diǎn)[3，4]。有研究表明，Wnt信號(hào)通路與肺、肝和腎纖維化的形成密切相關(guān)[5，6]。肝復(fù)康是本室發(fā)現(xiàn)的抗纖維化經(jīng)驗(yàn)方[7，8]。本實(shí)驗(yàn)將首次通過測(cè)定肝星狀細(xì)胞經(jīng)典Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子Wnt1、糖原合成激酶3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）、β-鏈蛋白（β-catenin）、細(xì)胞周期蛋白D1（cyclin D1）以及 α-平滑肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）等基因表達(dá)，以進(jìn)一步揭示肝復(fù)康抗肝纖維化的分子調(diào)節(jié)機(jī)制。

材料與方法

一、肝星狀細(xì)胞系 大鼠肝星狀細(xì)胞株（HSCT6）由上海中醫(yī)藥大學(xué)肝病研究所徐列明教授惠贈(zèng)，表型為活化的HSCs。在含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清（天津?yàn)笊锕荆?、含青鏈霉素?00U/ml的DMEM（高糖）培養(yǎng)基（Hyclone公司）、37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)5%、飽和濕度的條件下培養(yǎng)HSC-T6細(xì)胞，用0.25%胰酶消化傳代。

二、藥物的制備 肝復(fù)康由柴胡、當(dāng)歸、黃芪、赤芍、白芍、丹參等組成。其無菌原液由本校中西醫(yī)結(jié)合研究所按既定的工藝制備（1.95g/ml）。

三、含藥血清的制備 清潔級(jí)SD大鼠20只，雌雄各半，體重300～350g。隨機(jī)分為正常對(duì)照組和肝復(fù)康組，各10只。將肝復(fù)康按4.16ml/只分別給大鼠灌胃7次，每次間隔24小時(shí)，第7次灌胃前12小時(shí)禁食，在灌胃后1小時(shí)以苯巴比妥鈉腹腔注射麻醉，在無菌條件下行下腔靜脈取血約10ml，在4℃ 3000r/min離心10min，血清用0.22μm濾器過濾，即為藥物血清；對(duì)照組動(dòng)物以生理鹽水代替藥物灌胃。所有血清均經(jīng)56℃、30min滅活，置-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

四、HSC干預(yù)實(shí)驗(yàn) 將傳代培養(yǎng)的HSC按常規(guī)方法（105/cm）接種于6孔板中，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，次日換液，以后每2～3天換液一次。待細(xì)胞近鋪滿孔底（＞80%）時(shí)，換無血清的DMEM培養(yǎng)24小時(shí)，吸棄上清，而后分為3組：即空白對(duì)照組：加10%正常對(duì)照血清的DMEM；模型組：加10%正常對(duì)照血清+乙醛（終濃度150μm/L）；肝復(fù)康組：加10%肝復(fù)康中劑量藥物血清+乙醛（終濃度150μm/L），培養(yǎng)24小時(shí)，再分別收集細(xì)胞。

五、Western-Blot檢測(cè) β-catenin和 α-SMA表達(dá) 小鼠抗β-catenin單克隆抗體（工作濃度1:200）購自Santa公司；兔抗α-SMA多克隆抗體（工作濃度1:200）購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。細(xì)胞總蛋白的提取參照文獻(xiàn)[9]，考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定其濃度。取25μg蛋白上樣，進(jìn)行SDS-PAGE，分別用5%濃縮膠、10%和12%的分離膠電泳，使用Tris-甘氨酸電泳緩沖液、電壓20mA、PVDF膜進(jìn)行半干式電轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)膜時(shí)間分別為1小時(shí)和30分鐘。將膜放入封閉液（5%脫脂奶粉）中封閉3小時(shí)，加入一抗4℃過夜，TBST漂洗10min×3，分別加入二抗-辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠 IgG（1∶2000）和羊抗兔 IgG（1∶3000），37℃孵育1h，TBST漂洗10min×3。采用化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行顯色反應(yīng)，重復(fù)3次，結(jié)果用光密度掃描儀記錄，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

六、RT-PCR 法檢測(cè) Wnt1、GSK-3β、β-catenin、cyclin D1和α-SMA mRNA水平 使用TrizolTM試劑盒（Invitrogen公司）和RT-PCR兩步法試劑盒（北京天根）。在90mm培養(yǎng)皿中加入0.5mlTrizol試劑，提取細(xì)胞總RNA，1%瓊脂糖凝膠電泳，用分光光度計(jì)測(cè)定RNA水平及純度。A260/A280均在 1.18～2.10。cDNA的合成采用RT-PCR兩步法，20μL逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，AMV Reverse Transcriptase 1μL，RNA 酶抑制劑 0.5μL，MgCl24μL（2.0mmol/L），Oligodt1μL，內(nèi)含待測(cè)RNA 300ng，其余按推薦的試劑及濃度加入到反應(yīng)體系。擴(kuò)增 PCR：反應(yīng)體系為 50μL，5×buffer10μL，分別加入 Wnt1、GSK-3β、β-catenin、cyclin D1 和 α-SMA 引物（20μmol/L）各 0.5μL，用PCR 儀擴(kuò)增。擴(kuò)增結(jié)束后，取5μl擴(kuò)增產(chǎn)物在TBE緩沖液中行1.5%瓊脂糖凝膠電泳（制膠時(shí)在20ml瓊脂糖溶液中滴入濃度為10mg/ml溴化乙錠2μl），電泳結(jié)束后，在凝膠成像儀上拍照并進(jìn)行圖像分析。引物：設(shè)置β-actin為參照，由大連TAKARA公司合成，引物序列見表1。

表1 引物序列

七、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS11.5軟件包完成統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。所有數(shù)據(jù)均用表示，組間比較采用單因素方差分析，采用LSD法進(jìn)行兩兩比較。采用Pearson法進(jìn)行相關(guān)分析。P＜0.05為差異有意義，P＜0.01為差異有顯著性意義。

結(jié)果

一、肝復(fù)康藥物血清對(duì) Wnt1、GSK-3β和βcatenin mRNA表達(dá)的影響 各組HSC細(xì)胞β-actin表達(dá)量一致。在正常對(duì)照HSC中，Wnt1和β-catenin mRNA均有表達(dá)，但程度較弱；在乙醛刺激的模型組HSC中，兩者mRNA的表達(dá)明顯上調(diào)，與正常對(duì)照組比有顯著性差異（P＜0.01）；在藥物血清處理的HSC細(xì)胞，Wnt1和β-catenin mRNA的表達(dá)較模型組明顯下調(diào)，有顯著性差異（P＜0.01），且與正常對(duì)照組比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與此相反，GSK-3βmRNA 在乙醛刺激的模型組HSC中表達(dá)明顯下調(diào)，而在藥物血清處理的HSC細(xì)胞中的表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.01，圖1）。

圖1 Wnt1、GSK-3β、β-catenin mRNA 水平

二、肝復(fù)康藥物血清對(duì)β-catenin蛋白表達(dá)的影響 在乙醛刺激的模型組HSC細(xì)胞，β-catenin蛋白表達(dá)明顯升高，與正常組比有顯著性差異（P＜0.01）；在藥物血清處理組HSC細(xì)胞，β-catenin表達(dá)較模型組明顯下降（P＜0.01，圖 2）。

圖2 β-catenin蛋白表達(dá)情況

三、肝復(fù)康藥物血清對(duì)經(jīng)典Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路靶基因CyclinD1mRNA表達(dá)的影響 乙醛刺激的模型組HSC細(xì)胞CyclinD1mRNA表達(dá)明顯升高，與正常組比有顯著性差異（P＜0.01）。藥物血清處理組HSC細(xì)胞CyclinD1mRNA表達(dá)較模型組明顯下降，差異有顯著性（P＜0.01，圖 3）。

圖3 CyclinD1mRNA表達(dá)情況

四、肝復(fù)康藥物血清對(duì)α-SMA表達(dá)的影響 乙醛刺激的模型組HSC細(xì)胞α-SMA蛋白表達(dá)明顯升高，與正常組比有顯著性差異（P＜0.01）。藥物血清處理組HSC細(xì)胞α-SMA表達(dá)較模型組明顯下降，差異有顯著性（P＜0.01，圖 4）。

圖4 α-SMA蛋白及其mRNA表達(dá)情況

五、α-SMA mRNA 與 Wnt1、β-catenin和 Cyclin-D1表達(dá)的相關(guān)性分析 α-SMA mRNA的表達(dá)與其他三者mRNA表達(dá)均呈顯著正相關(guān)。

討論

分泌性糖脂蛋白Wnt家族介導(dǎo)的信號(hào)是在胚胎生長(zhǎng)和組織穩(wěn)態(tài)中指導(dǎo)細(xì)胞增殖和細(xì)胞極性并決定細(xì)胞命運(yùn)的一個(gè)基本機(jī)制[10]。因此，Wnt信號(hào)通路突變通常與人類的生長(zhǎng)缺陷、癌癥和其他的一些疾病密切相關(guān)[3，4]。目前已發(fā)現(xiàn)至少3條Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，包括經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、細(xì)胞極性通路和Wnt/Ca2+通路。其中Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是目前研究比較多、比較深入的一條分支。當(dāng)經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被激活時(shí)，Wnt配體與跨膜受體Frizzled及其輔助受體Lrp5/Lrp6結(jié)合形成復(fù)合物并激活受體，進(jìn)而激活胞內(nèi)的Dsh，導(dǎo)致GSK-3β活性受到抑制，阻止APC-axin-GSK-3β降解復(fù)合體的形成，使β-catenin不被磷酸化和降解，而在胞漿內(nèi)積累。當(dāng)胞內(nèi)β-catenin水平升高后，游離的β-catenin發(fā)生核轉(zhuǎn)移，與轉(zhuǎn)錄因子Lef/Tcf結(jié)合，形成轉(zhuǎn)錄激活復(fù)合體，最終實(shí)現(xiàn)某些特定基因的表達(dá)，如c-myc、周期素 D1（CyclinD1）和 MMP7 等的增強(qiáng)或者減弱[11，12]。

近年研究表明，經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與肺纖維化和腎纖維化等密切相關(guān)[13，14]。有學(xué)者指出，經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路可以使HSCs維持靜止?fàn)顟B(tài)[15]。也有學(xué)者認(rèn)為，Wnt信號(hào)能夠增強(qiáng)HSCs的活性[16]，而關(guān)于藥物干預(yù)的研究尚未見報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)研究了經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的一些關(guān)鍵基因的表達(dá)情況。結(jié)果表明，乙醛刺激的模型組Wnt1和β-catenin表達(dá)增高，GSK-3β表達(dá)下降，經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在乙醛刺激的模型組被激活了，而肝復(fù)康藥物血清處理能夠明顯改善上述變化，說明肝復(fù)康可能通過抑制經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路從而達(dá)到抑制HSCS增殖，減少炎癥的發(fā)生，而具有抗肝纖維化的作用。

當(dāng)然，經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路最終是通過其靶基因來發(fā)揮效應(yīng)的。在眾多推論的靶基因中，CyclinD1被普遍認(rèn)為能調(diào)控細(xì)胞進(jìn)入S期和G2/M期的增殖和分化[17]。

到目前為止，經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與α-SMA基因表達(dá)之間的關(guān)系尚未見報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，三者表達(dá)呈顯著正相關(guān)。因此，我們推測(cè)在肝纖維化發(fā)生過程中，經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被激活，從而促進(jìn)HSCs的活化，進(jìn)而增加α-SMA的表達(dá)，但其中的分子生物學(xué)機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

[1]CADIGAN KM，NUSSE R.Wnt signaling:a common theme in animal development[J].Genes Dev，1997，11:3286-3305.

[2]LEE PN，PANG K，MATUS DQ，et al.A WNT of things to come:evolution of Wnt signaling and polarity in cnidarians[J].Semin Cell Dev Biol，2006，17:157-167.

[3]KIKUCHI A，YAMAMOTO H.Tumor formation due to abnormalities in the beta-catenin-independent pathway of Wnt signaling[J].Cancer Sci，2008，99（2）:202-208.

[4]ZHANG B，ZHOU KK，MA JX.Inhibition of connective tissue growth factor overexpression in diabetic retinopathy by SERPINA3K via blocking the WNT/beta-catenin pathway[J].Diabetes，2010，59（7）:1809-1816.

[5]MORRISEY EE.Wnt signaling and pulmonary fibrosis[J].Am J Pathol，2003，162（5）:1393-1397.

[6]HE W，DAI C，LI Y，et al.Wnt/beta-catenin signaling promotes renal interstitial fibrosis[J].J Am Soc Nephrol，2009，20（4）:765-776.

[7]車穎，徐婷婷，姜妙娜，等.肝復(fù)康對(duì)實(shí)驗(yàn)性肝纖維化大鼠肝細(xì)胞的保護(hù)作用[J]. 中藥材，2004，27（6）:428-429.

[8]車穎，王善菊，徐婷婷，等.中藥肝復(fù)康對(duì)實(shí)驗(yàn)性肝纖維化大鼠肝功能及血清標(biāo)志物的影響[J].放射免疫學(xué)雜志，2004，17（4）:283-284.

[9]DIGNAM JD，LEBOVITZ RM，ROEDER RG.Accurate transcription initiation by RNA polymerase II in a soluble extract from isolated mammalian nuclei[J].Nucleic Acids Res，1983，11:1475-1489.

[10]ZHAO J，KIM KA，ABO A.Tipping the balance:modulating the Wnt pathway for tissue repair[J].Trends Biotechnol，2009，27:131-136.

[11]HUANG H，HE X.Wnt/beta-catenin signaling:new （and old）players and new insights[J].Curr Opin Cell Biol，2008，20:119-125.

[12]LING L，NURCOMBE V，COOL SM.Wnt signaling controls the fate of mesenchymal stem cells[J].Gene，2009，433:1-7.

[13]KONIGSHOFF M，BALSARA N，PFAFF EM，et al.Functional Wnt signaling is increased in idiopathic pulmonary fibrosis[J].PLoS One，2008，3:e2142.

[14]KIM TH，KIM SH，SEO JY，et al.Blockade of the Wnt/β -catenin pathway attenuates bleomycin-induced pulmonary fibrosis[J].Tohoku J Exp Med，2011，223（1）:45-54.

[15]CLAUS K，IRIS S，DIETER H.Canonical Wnt signaling maintains the quiescent stage of hepatic stellate cells[J].Biochem Biophys Res Commun，2008，367:116-123.

[16]MYUNGA SJ，YOONA，JH，GWAK GY.Wnt signaling enhances the activation and survival of human hepatic stellate cells[J].FEBS Letters，2007，581:2954-2958.

[17]ALBRECHT JH，HANASEN LK.CyclinD1 promotes mitogenindependent cell cycle progression in hepatocytes[J].Cell Growth Differe，1999，10:397-404.