熊 熙 汪茂榮

南蛇藤（Celastrus orbiculatus Thunb）為衛(wèi)矛科南蛇藤（celastrus）屬植物，分布廣泛，其藤莖、根、葉、果均可入藥?，F(xiàn)代藥物化學(xué)研究證實(shí)，其具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒、抗生育和鎮(zhèn)痛等廣泛的藥理活性[1]。為進(jìn)一步研究南蛇藤抗腫瘤的作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用體外細(xì)胞模型研究了南蛇藤乙酸乙酯提取物對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用，現(xiàn)報(bào)告如下。

材料與方法

一、材料及主要試劑 HepG2細(xì)胞購自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞研究所。南蛇藤乙酸乙酯提取物由揚(yáng)州大學(xué)劉延慶教授贈(zèng)送。DMEM培養(yǎng)基（HyClong公司）；胎牛血清（美國(guó)ExCell公司）；CCK-8試劑盒（主要成分WST-8，日本株式會(huì)社同仁化學(xué)研究所）；Alexa Fluor 488 annexin V-PI試劑盒（美國(guó)Invitrogen公司）；碘化丙啶（PI，杭州聯(lián)科生物公司）；Caspase-3凋亡比色法試劑盒（美國(guó)Biovision公司）；BCA蛋白定量試劑盒（美國(guó)Pierce公司）；其它試劑均為進(jìn)口分裝或國(guó)產(chǎn)分析純，購自南京生興公司。

二、HepG2細(xì)胞培養(yǎng) 取適量?jī)龃娴腍epG2細(xì)胞復(fù)蘇，接種在含10%胎牛血清的DMEM（含100U/ml青霉素和100U/ml鏈霉素）培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，置入37℃、5%CO2飽和濃度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2天傳代1次。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

三、南蛇藤乙酸乙酯提取物對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響 采用CCK-8法檢測(cè)。取HepG2細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，每孔5×104個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24h，棄培養(yǎng)基，加入含不同濃度的南蛇藤提取物培養(yǎng)基100μl/孔，終濃度分別為 300μg/ml、240μg/ml、120μg/ml、60μg/ml、30μg/ml、15μg/ml和陰性對(duì)照組；陰性對(duì)照組加入等體積的DMEM；同時(shí)設(shè)本底空白對(duì)照組。每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中分別繼續(xù)培養(yǎng) 24h、48h 和 72h，然后每孔加入 WST-810μl，繼續(xù)培養(yǎng)1h后，在酶標(biāo)儀上檢測(cè)450nm吸光度，計(jì)算藥物對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率，即：

細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率（%）=（對(duì)照組OD值-用藥組OD值）/對(duì)照組OD值×100%

四、細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的檢測(cè) 采用流式細(xì)胞術(shù)，在藥物作用24h后，加胰酶消化、1000rpm離心，收集細(xì)胞，同時(shí)用冷的PBS沖洗2次，加70%乙醇固定，4℃過夜。離心去除乙醇，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×106個(gè)/mL。加入終濃度為10mg/L PI 500μl，室溫避光30min后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布。按Annexin V-PI試劑盒說明進(jìn)行凋亡率的檢測(cè)。

五、凋亡細(xì)胞caspase-3活性檢測(cè) 采用比色法，取細(xì)胞 5×105/孔接種到6孔板中，培養(yǎng)24h后，消化、收集。同時(shí)設(shè)空白（lysis buffer+2×reaction buffer）對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度（120μg/ml、60μg/ml和 30μg/ml）南蛇藤提取物，陰性對(duì)照加入等體積的DMEM。處理24h和48h后收集細(xì)胞，1000g離心5min，PBS洗2次，去除上清。在收集的沉淀細(xì)胞中加入50μl冰冷裂解緩沖液，置冰上裂解20min，蝸旋振蕩10s，10000g，4℃離心1min。把離心上清液轉(zhuǎn)移至新的EP管中，并放置冰上，測(cè)定蛋白濃度。吸取50μl含50μg蛋白的細(xì)胞裂解上清，如體積不足50μl，則用裂解緩沖液補(bǔ)足。加入50μl 2×反應(yīng)緩沖液；加入5μl Caspase-3底物，并于37℃避光孵育4h；在酶標(biāo)儀上以405nm波長(zhǎng)測(cè)定其吸光度OD值。

Caspase-3活化度=（南蛇藤組OD值-空白對(duì)照組OD值）/（陰性對(duì)照組OD值-空白對(duì)照組OD值）。同時(shí)測(cè)定并繪制pNA標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算一個(gè)樣品單位重量蛋白中所含的caspase 3酶的活力單位。

結(jié)果

一、對(duì)HepG2細(xì)胞的抑制作用 隨藥物濃度升高，其對(duì)細(xì)胞增殖的抑制率也增高，并隨作用時(shí)間延長(zhǎng)而增強(qiáng)（圖 1）；藥物作用 24h，其 IC50為 111.8μg/ml，作用 48h，其 IC50為 99.7μg/ml，作用 72 小時(shí)，其IC50為43.0μg/ml（圖2）。

圖1 不同濃度的南蛇藤乙酸乙酯提取物對(duì)Hep細(xì)胞的抑制作用

圖2 不同時(shí)間點(diǎn)下南蛇藤乙酸乙酯提取物作用HepG2細(xì)胞的IC50

二、南蛇藤乙酸乙酯提取物作用前后細(xì)胞周期的變化 在G0-G1峰前出現(xiàn)一個(gè)DNA減少的亞二倍體峰，即凋亡峰，即隨藥物劑量增大凋亡峰增高（圖3）；與陰性對(duì)照組比較，在 30μg/ml、60μg/ml、120μg/ml和240μg/ml藥物作用細(xì)胞24h后，細(xì)胞進(jìn)入G0-G1增多（圖 4）。

圖3 南蛇藤乙酸乙酯提取物作用HepG2細(xì)胞后DNA水平的變化

圖4 不同濃度的南蛇藤乙酸乙酯提取物作用HepG2細(xì)胞后細(xì)胞周期的變化

三、南蛇藤乙酸乙酯提取物誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡的作用 從annexin V和PI熒光雙參數(shù)點(diǎn)圖（圖5）觀察到，對(duì)照組細(xì)胞主要分布在3區(qū)，有少量因操作等原因引起的機(jī)械性細(xì)胞死亡（數(shù)量＜8%）；隨南蛇藤提取物濃度升高，凋亡細(xì)胞相應(yīng)增加。與對(duì)照組比較，15μg/ml、30μg/ml和 60μg/ml南蛇藤提取物處理組細(xì)胞凋亡率之間有顯著性差異（F=5.449，P＜0.05，圖6）。但當(dāng)藥物濃度為120μg/ml和240μg/ml時(shí)并作用24h后，細(xì)胞凋亡率下降。

圖5 南蛇藤乙酸乙酯提取物誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡后的熒光雙參數(shù)圖

圖6 不同濃度的南蛇藤乙酸乙酯提取物產(chǎn)生的HepG2細(xì)胞凋亡率

四、南蛇藤乙酸乙酯提取物對(duì)HepG2細(xì)胞中Caspase-3活性的影響 經(jīng)藥物處理24h后，細(xì)胞內(nèi)caspase-3活性上升，有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=53.439，P＜0.01）；經(jīng)藥物處理48h后，細(xì)胞內(nèi)caspase-3活性上升，有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=，3.558，P＜0.05）。在120μg/ml南蛇藤提取物作用24h時(shí)，caspase-3活性出現(xiàn)峰濃度（圖7）。

圖7 不同濃度南蛇藤乙酸乙酯提取物作用細(xì)胞24h、48h的caspase-3活性

討 論

有多種方法可檢測(cè)細(xì)胞凋亡[2～8]。研究細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的調(diào)控機(jī)制有助于抗癌藥物的篩選。

南蛇藤提取物對(duì)HepG2細(xì)胞有明顯的抑制作用，且與藥物作用時(shí)間和劑量相關(guān)，即有量效和時(shí)效關(guān)系。當(dāng)南蛇藤乙酸乙酯提取物在120μg/ml時(shí)，對(duì)細(xì)胞的抑制率大于 50%，其 IC50=111.8±2.90μg/ml，與張艦和許運(yùn)明等[9]的研究結(jié)果接近。當(dāng)藥物作用48h時(shí)的 IC50 為 99.7±2.82μg/ml，而毛建山[10]應(yīng)用從粉背南蛇藤中提取的新三萜化合物對(duì)RKO細(xì)胞作用48h時(shí)，其IC50為12.20±0.79μg/ml。有多種因素可造成這種偏差，如所用細(xì)胞系、凋亡誘導(dǎo)劑、藥物濃度或刺激強(qiáng)度和暴露時(shí)間等[11]。經(jīng)流式細(xì)胞儀分析表明，在15～240μg/ml南蛇藤提取物作用細(xì)胞24h促凋亡作用明顯，細(xì)胞周期阻滯在G0-G1期，而G2-M期細(xì)胞明顯減少，S期細(xì)胞則無明顯變化。南蛇藤乙酸乙酯提取物在30μg/ml時(shí)即有明顯地誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。由于細(xì)胞周期分析實(shí)驗(yàn)和Annexin V-PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法的局限性，在高濃度藥物作用24h后，誘導(dǎo)的細(xì)胞有可能已經(jīng)進(jìn)入凋亡的中晚期，而細(xì)胞凋亡并不隨藥物濃度的增加而更明顯。

本研究表明，南蛇藤乙酸乙酯提取物具有抑制HepG2細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，抑制細(xì)胞增殖的機(jī)制可能與它能使細(xì)胞周期停滯在G0-G1期和引起細(xì)胞凋亡有關(guān)，其促凋亡的機(jī)制可能與增加Caspase-3活性有關(guān)。

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