汪 青,包永波,林志華,劉浩明

(1.上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院,上海 201306; 2.浙江萬里學(xué)院 生物與環(huán)境學(xué)院,浙江 寧波 315100)

血紅細(xì)胞作為動物最重要的氣體運(yùn)輸和氣體交換的載體,是血液中含量最多的血細(xì)胞。從低等動物到高等動物,隨著動物的生境由水生變?yōu)殛懮⒒顒涌臻g不斷增大、活動劇烈程度不斷增強(qiáng),動物本身對氧氣運(yùn)輸?shù)男枨蟛粩嘣黾右约皠游镅?xì)胞逐漸分化使得動物的血紅細(xì)胞紅細(xì)胞發(fā)生著相應(yīng)的變化。

關(guān)于各種動物的血細(xì)胞研究,前人做過一些報(bào)道。羅曼等[1]通過電鏡對黃緣閉殼龜(Cuora flavomarginata)血細(xì)胞亞顯微形態(tài)結(jié)構(gòu)進(jìn)行掃描和透射觀察; 陳玉琴等[2]利用光鏡和掃描電鏡觀察紅腹錦雞(Chrysolophus pictus)血細(xì)胞的形態(tài)特征; 曹伏君和劉楚吾[3]對花尾胡椒鯛(Plectorhinchus cinctus)進(jìn)行光鏡及掃描電鏡觀察,鑒定血細(xì)胞的種類、形態(tài)及功能; 潘鴻春[4]運(yùn)用透射電鏡研究虎紋蛙(Rana rugulosa)外周血細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu); 張維翥等[5]通過光鏡、掃描電鏡和透射電鏡觀察對海灣扇貝(Argopecten irradians)血細(xì)胞的形態(tài)、表面結(jié)構(gòu)和超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究; 劉志鴻等[6]、潘莎芳等[7]分別對泥蚶(Tegillarca granosa)、毛蚶(Scapharca subcrenata)血細(xì)胞形態(tài)和抗菌作用進(jìn)行了觀察; 姜勇和雷朝亮[8]運(yùn)用掃描電鏡觀察家蠅(Musca domestica)血細(xì)胞。然而對多種不同生物進(jìn)行血紅細(xì)胞的比較研究,從進(jìn)化角度方面開展的血細(xì)胞研究則相對較少,Hartman和Lessler[9]在光鏡下觀察和測量8種魚類動物、5種兩棲類動物、33種爬行類動物紅細(xì)胞的大小,分析紅細(xì)胞大小變化的規(guī)律; Bhattacharyya等[10]利用原子力顯微鏡和橫向力顯微鏡,觀察并分析人、家雞、樹蜥、蟾蜍、魚紅細(xì)胞表面超微結(jié)構(gòu)特征。然而對于脊椎動物和無脊椎動物,尤其是貝類動物中具有紅色血液的蚶科貝類的紅細(xì)胞的比較分析,目前尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。

本文旨在研究蚶科貝類血紅細(xì)胞的形態(tài)特征和微觀結(jié)構(gòu),及與其他水產(chǎn)動物血紅細(xì)胞差異比較,以探究血紅細(xì)胞形態(tài)進(jìn)化特征。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用動物泥蚶、毛蚶、鯽魚(Carassius auratus)、牛蛙(Rana catesbeiana)、中華鱉(Pelodiscus sinensis)均購自寧波鐘公廟菜市場,體質(zhì)健康。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

Hemacolor染液(默克,德國),2.5%的戊二醛(pH 7.2),日立-3400N掃描電鏡,Olympus BX-51顯微鏡。

1.3 光鏡及電鏡樣品制備

血液采集及制作血涂片：泥蚶、毛蚶用開殼器開殼,用一次性針管抽取外套膜中血竇內(nèi)血液; 鯽魚在尾部靜脈吸取血液; 牛蛙采用雙毀髓法,心臟取血; 中華鱉采用頸靜脈抽血; 將采集的血液立即滴在載玻片的一側(cè),用干凈的載玻片推片,制作血涂片。

細(xì)胞學(xué)染色及觀察：用 Hemacolor染液染色,Olympus BX-51顯微鏡觀察并拍照; 細(xì)胞形態(tài)參數(shù)用DT2000圖像分析軟件進(jìn)行測量; 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及顯著性檢驗(yàn)(ANOVA)用SPSS軟件完成。

掃描電鏡樣品制備：用一次性針管吸取血液0.3mL,滴入 2.5%的戊二醛(pH 7.2)中進(jìn)行固定; 樣品固定后,進(jìn)行樣品處理及掃描電鏡觀察。

2 結(jié)果

2.1 光鏡觀察結(jié)果

泥蚶、毛蚶作為低等動物,其紅細(xì)胞的外形與脊椎動物有較大的不同,細(xì)胞表面多有不規(guī)則透明區(qū)域,且蚶科動物細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含有藍(lán)紫色嗜堿性顆?；蚝稚人嵝灶w粒,或者兩者兼有(圖 1(1),(2); 表 1);而從鯽魚開始,脊椎動物的紅細(xì)胞表面變得光滑,細(xì)胞質(zhì)均一,無顆粒(圖1,表1)。

圖1 采用光鏡觀察的5種水產(chǎn)動物血紅細(xì)胞形態(tài)Fig.1 Observation of erythrocytes of five aquatic animals by light microscope

表1 5種水產(chǎn)動物血紅細(xì)胞在光鏡觀察下的外形特征Tab.1 Morphological characteristics of erythrocytes of five aquatic animals by light microscope

在紅細(xì)胞大小方面,蚶科貝類(泥蚶、毛蚶)大小相似,無明顯差異; 鯽魚血紅細(xì)胞的大小與兩種貝類并無明顯差別; 牛蛙紅細(xì)胞直徑和長寬比更大;中華鱉紅細(xì)胞的直徑和長寬比則較牛蛙小; 同樣,5種水產(chǎn)動物紅細(xì)胞的細(xì)胞核直徑、細(xì)胞核長寬比也呈現(xiàn)與紅細(xì)胞直徑變化相似的趨勢(表2)。

2.2 掃描電鏡觀察

2種蚶科貝類在掃描電鏡下結(jié)構(gòu)相似,具有明顯的波狀皺褶(F)和凹陷(G),偶見有分泌小泡的存在(E); 泥蚶、毛蚶兩種軟體動物血紅細(xì)胞表面的透明區(qū)域可能是由于該區(qū)域細(xì)胞較薄,染色較淺造成,掃描電鏡觀察到的表面凹陷可能就是該區(qū)域; 與光鏡觀察結(jié)果相似,脊椎動物血紅細(xì)胞從最低等的鯽魚開始,便與 2種貝類血紅細(xì)胞的表面結(jié)構(gòu)有顯著不同：鯽魚等 3種脊椎動物血紅細(xì)胞表面波狀褶皺已經(jīng)消失; 可以見到較多的凹陷和隆起,但細(xì)胞表面隆起的程度和表面凹陷程度逐漸降低(圖2,表3)。

表2 5種水產(chǎn)動物血紅細(xì)胞光鏡下的細(xì)胞大小Tab.2 Measurements of erythrocytes of five aquatic animals by light microscope

圖2 采用掃描電鏡觀察的5種水產(chǎn)動物血紅細(xì)胞形態(tài)Fig.2 Observation of erythrocytes of five aquatic animals by scanning electronic microscope

表3 5種水產(chǎn)動物血紅細(xì)胞掃描電鏡觀察Tab.3 Observation of erythrocytes of five aquatic animals by scanning electronic microscope

3 討論

3.1 蚶科貝類血紅細(xì)胞形態(tài)分析

蚶科貝類作為少數(shù)具有紅色血液的軟體動物,其所擁有的血紅蛋白在進(jìn)化地位上的特殊性一直備受關(guān)注[11-14]。然而關(guān)于蚶科貝類所擁有的血紅細(xì)胞的研究鮮有報(bào)道,尤其是從進(jìn)化角度探討蚶科動物血紅細(xì)胞的特殊性的研究。關(guān)于蚶科貝類血紅細(xì)胞與脊椎動物血紅細(xì)胞的進(jìn)化關(guān)系未見報(bào)道。本研究結(jié)果表明：蚶科動物血紅細(xì)胞的形態(tài)特征與高等動物有較大差異,但符合血紅細(xì)胞形態(tài)特征的變化規(guī)律。

毛蚶與泥蚶分類學(xué)上同屬于蚶目蚶科,埋棲型貝類,分別埋居于泥沙和軟泥底中,無水管,僅以殼后緣在灘涂表面形成水孔與外界相通。泥蚶和毛蚶分類學(xué)地位和生活習(xí)性的相似性可能導(dǎo)致了兩種蚶科貝類血紅細(xì)胞形態(tài)極為相似：兩種蚶科貝類大小與形態(tài)相似,都具有嗜酸性或嗜堿性顆粒,表面都具有極為明顯的褶皺和凹陷(圖1(1),(2),圖2(1),(2))。

泥蚶、毛蚶兩種軟體動物血紅細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含有的嗜堿性和嗜酸性顆粒,有研究認(rèn)為這些顆粒為溶酶體[6-7,15]; 而鯽魚等3種脊椎動物血紅細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)均一,無顆粒(圖1)。這是由于蚶科貝類(如泥蚶、毛蚶等貝類)血細(xì)胞沒有完全分化,免疫系統(tǒng)不完善,需要自身吞噬作用發(fā)揮抗菌作用[5-6,15-18]。周永燦和潘金培[19]認(rèn)為在貝類中參與免疫的主效因子是血紅細(xì)胞,由于貝類不具有特異性免疫,只有細(xì)胞和體液的非特異性免疫系統(tǒng),因此,血紅細(xì)胞對貝類免疫來說至關(guān)重要,它是貝類體內(nèi)抵御外來病原生物侵襲的主要“屏障”。劉世良等[20]發(fā)現(xiàn)貝類血紅細(xì)胞的功能與維持體內(nèi)各種生理環(huán)境的穩(wěn)定性有密切關(guān)系,血紅細(xì)胞除具有營養(yǎng)、防御的功能,主要通過參與包埋,吞噬,結(jié)節(jié)形成,細(xì)胞凝塊和傷口修復(fù)等過程起到免疫防御作用。這表明泥蚶、毛蚶等蚶科動物血紅細(xì)胞與脊椎動物血液內(nèi)的免疫細(xì)胞具有相似的功能,承擔(dān)了部分免疫功能。

3.2 蚶科貝類與其他 3種水產(chǎn)脊椎動物血紅細(xì)胞比較分析

隨著生物進(jìn)化,動物血細(xì)胞種類增多,功能逐漸分化,血紅細(xì)胞專職于進(jìn)行氣體交換。研究推測,隨著生物對氧氣的供應(yīng)需求逐漸增高,使得血紅細(xì)胞以增加氣體運(yùn)輸量和氣體交換效率為基準(zhǔn)不斷進(jìn)化,這甚至體現(xiàn)在紅細(xì)胞的形態(tài)和表面結(jié)構(gòu)上。

兩種蚶類與鯽魚在血紅細(xì)胞大小上有較大差距,蚶類血紅細(xì)胞圓厚,而鯽魚則扁薄; 而與鯽魚相比,牛蛙血紅細(xì)胞更扁薄,血紅細(xì)胞直徑更長(表 1)。Hartman和 Lessler[9]認(rèn)為相同體積情況下,橢圓形的血紅細(xì)胞比球形血紅細(xì)胞更加有利于交換氣體。這說明從軟體動物到兩棲類動物血紅細(xì)胞交換氣體的功能逐漸增強(qiáng)。從軟體動物到兩棲類動物,生物活動空間及活動劇烈程度逐漸增加,由水生向陸生進(jìn)化,由水中獲氧轉(zhuǎn)向空氣中獲氧,這使得生物發(fā)展了肺,逐漸增強(qiáng)生物氣體交換的效率。紅細(xì)胞也隨著這一過程協(xié)同進(jìn)化：由于氧氣運(yùn)輸?shù)男实拖?生物對氧氣的需求越來越多,從軟體動物到魚類再到兩棲類動物,動物血紅細(xì)胞體積顯著增大,并且使細(xì)胞變得橢圓和扁薄,以獲得更大的氣體交換效率。

一般來說,進(jìn)化地位越高等的動物,紅細(xì)胞越小,數(shù)量越多。這是因?yàn)榧t細(xì)胞體積的縮小會帶來表面積的增加,起到提高呼吸機(jī)能的作用[9]。從兩棲類到爬行類,血紅細(xì)胞長寬比逐漸減小,體積逐漸減小,紅細(xì)胞數(shù)量逐漸增多[9],使得紅細(xì)胞比面積不斷增大,因此血紅細(xì)胞氣體交換能力不斷增強(qiáng)。推測從兩棲類到爬行類再到哺乳類,動物活動的空間越來越大,活動也更加劇烈,對氧氣的需求更大。這使得動物組織細(xì)胞需要更有效率的氣體交換,于是生物體逐漸進(jìn)化出毛細(xì)血管和體積更小、數(shù)量更多的血紅細(xì)胞,從而極大地增大了生物體氣體交換速率,更有利于生物的生存。血紅細(xì)胞體積小巧,使得其在動物血液中流動更容易; 紅細(xì)胞越小,動物產(chǎn)生紅細(xì)胞的速度也會更快,這樣可以加快紅細(xì)胞的更新速率,更有利于動物的生存,逐漸為生物進(jìn)化所保留。

血紅細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)特征與生物的進(jìn)化有密切的聯(lián)系。泥蚶、毛蚶血紅細(xì)胞表面皺褶與凹陷顯著,而從鯽魚開始,脊椎動物血紅細(xì)胞的表面結(jié)構(gòu)逐漸趨于光滑。我們推測雖然蚶類“紅細(xì)胞”血紅蛋白結(jié)合氧氣能力較低[11-12],但是蚶類血紅細(xì)胞的表面皺褶和凹陷非常明顯,顯著的表面皺褶和凹陷,增加了紅細(xì)胞與外界的接觸面積,使得紅細(xì)胞內(nèi)血紅蛋白接觸氧氣的面積更大,讓更多的血紅蛋白與氧氣結(jié)合,從而可以間接地增加了血紅細(xì)胞對氧氣的運(yùn)載能力。Elgsaeter和Mikkelsen[21]認(rèn)為血紅細(xì)胞的細(xì)胞膜可以維持血紅細(xì)胞的形狀,并且可以防止由于血紅細(xì)胞在通過毛細(xì)血管時變形而導(dǎo)致的細(xì)胞破碎的發(fā)生。研究推測血紅細(xì)胞表面皺褶和凹陷太過劇烈可能會導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定,而且生物逐漸發(fā)展了毛細(xì)血管,血紅細(xì)胞通過較小空間的毛細(xì)血管時,可能會導(dǎo)致細(xì)胞的破裂,因此,細(xì)胞表面逐漸趨向于變得光滑。

綜上可知,雖然蚶科動物血紅細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)顆粒、整體形態(tài)和表面結(jié)構(gòu)等與脊椎動物血紅細(xì)胞差異較大,但仍然符合血紅細(xì)胞的進(jìn)化規(guī)律,即血紅細(xì)胞功能逐步分化與完善; 外形逐漸趨向于體積小巧但比面積大的結(jié)構(gòu),血紅細(xì)胞表面則趨于光滑,以獲得最大的氣體交換效率與細(xì)胞的穩(wěn)定性。關(guān)于蚶科動物血紅細(xì)胞與脊椎動物血紅細(xì)胞進(jìn)化上的關(guān)系,目前只是從形態(tài)上加以分析,下一步我們會從分子和蛋白水平對泥蚶血紅細(xì)胞及血紅蛋白進(jìn)行更深入的研究,以期揭示泥蚶血紅蛋白的分子和蛋白結(jié)構(gòu)特征,分析其進(jìn)化地位。

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