王澤文,冷凱良翟毓秀孫偉紅邢麗紅苗鈞魁

(1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院 黃海水產(chǎn)研究所,山東 青島 266071;2.中國(guó)海洋大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東青島 266100)

海參(Sea cucumber)屬于棘皮動(dòng)物門(Echinodermata)、海參綱(Holothuroidea)[1]。其肉質(zhì)酥脆、香酥滑潤(rùn)、高蛋白質(zhì)、低脂肪、營(yíng)養(yǎng)豐富、味道鮮美,是“海味八珍”之一的佳肴和滋補(bǔ)保健品,素有“滋補(bǔ)靠海參、搶救靠人參”的說(shuō)法。

海參酸性黏多糖是海參特有的重要活性成分,目前已經(jīng)從刺參、花刺參、玉足海參、梅花參等海參體內(nèi)分離鑒定出酸性黏多糖,其含量約占干海參總有機(jī)物的 6%以上[2]。海參酸性黏多糖(Acid mucopolysaccharide)又稱為糖胺聚糖(Glycosaminoglycans),是由氨基半乳糖、葡萄糖醛酸、巖藻糖等組成的分支雜多糖,海參酸性黏多糖中硫酸酯基的含量非常高。近20年來(lái),國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)海參黏多糖及其異構(gòu)物的藥理作用進(jìn)行了大量研究,證實(shí)它具有抗凝血、降血脂、降低血黏度、抗腫瘤以及提高免疫功能等多種活性[3-4]。海參中的酸性黏多糖組成較復(fù)雜,如何準(zhǔn)確測(cè)定其含量一直被人們所關(guān)注。目前海參酸性黏多糖含量測(cè)定方法主要有薄層色譜法[5]、分光光度法[6],本實(shí)驗(yàn)利用亞甲基藍(lán)與海參多糖的異染效應(yīng),建立并完善了亞甲基藍(lán)顯色分光光度法測(cè)定多糖含量的技術(shù)。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于海參酸性黏多糖的研究多局限于同類或不同種類的整只海參中黏多糖含量研究,對(duì)海參不同組織的黏多糖含量測(cè)定至今鮮有報(bào)道。由于海參腸、卵及體壁是海參體中具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的主要部位,因此利用建立的方法測(cè)定了海參不同組織酸性黏多糖含量,為海參黏多糖的利用提供了數(shù)據(jù)支持和理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器與設(shè)備

LAMBDA750紫外可見分光光度計(jì)：美國(guó)珀金埃爾默公司;BT224S電子分析天平：法國(guó)沙多利斯公司;CR22G型離心機(jī)：日本日立公司;CS101-1EB烘箱：四川四達(dá)公司。

1.1.2 試劑

木瓜蛋白酶(上海藍(lán)季科技公司,酶活為 100萬(wàn)U/g) ;半胱氨酸(上?；菖d生化試劑公司,純度大于98.5%);乙酸鈉,EDTA、磷酸二氫鉀和磷酸氫二鈉、亞甲基藍(lán)溶液(0.4mmol/L)、D-甘露糖(Man)購(gòu)自天津博迪化工有限公司;巖藻糖(Fuc)、D-葡萄糖(Glu)、D-半乳糖(Gla) 購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

磷酸緩沖液(pH為5.0)：稱取磷酸二氫鉀1.701 2 g,溶于500 mL水中。稱取磷酸氫二鈉0.222 6 g溶于50 mL水中,取磷酸二氫鉀溶液490 mL,磷酸氫二鈉溶液10 mL混合,此緩沖液pH為5.0。

乙酸緩沖液(pH 為 6.0)：取乙酸鈉 54.6 g,加1 mol/L乙酸溶液20 mL溶解后,加水稀釋至500 mL。

多糖提取液：用乙酸緩沖液配制成濃度為 5 mmol/L半胱氨酸和EDTA的混合溶液,并加入木瓜蛋白酶(500 mL加1.67 g,準(zhǔn)確到0.001 g)。

酸性黏多糖標(biāo)準(zhǔn)品：Fluka公司提供,CAS號(hào)19072-19-9,硫酸酯基含量為9%～10%。以上試劑均為分析純級(jí)或優(yōu)級(jí)純,所用水為去離子水。

1.1.3 樣品

海參腸、海參卵、海參體壁凍干粉均由本實(shí)驗(yàn)室自制,該海參品種為刺參(Stichopus japonicus)。

1.2 方法

1.2.1 異染配合物最大吸收波長(zhǎng)的確定

取1mL亞甲基藍(lán)溶液于 10mL容量瓶中,用磷酸緩沖液定容至刻度,然后分別取0.2 g/L標(biāo)準(zhǔn)溶液0.4、0.8、1.0 mL于瓶中,加入1 mL亞甲基藍(lán)溶液,用磷酸緩沖液定容至10 mL。用紫外可見分光光度計(jì)從 350～750 nm進(jìn)行掃描,記取不同波長(zhǎng)下溶液的吸光值。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取 105℃干燥至恒重的海參多糖標(biāo)準(zhǔn)品,用磷酸緩沖液配置成0.2 g/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別取配好的多糖標(biāo)液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL,置于10 mL容量瓶中,向其中加入 1 mL亞甲基藍(lán)溶液,用磷酸緩沖溶液定容至刻度,配制成一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。未加標(biāo)準(zhǔn)的溶液作為空白參比樣。以多糖含量為橫坐標(biāo),吸光值為縱坐標(biāo),在564 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 樣品的處理

取海參各組織樣品,于冷凍干燥機(jī)中凍干,準(zhǔn)確稱取 1 g凍干后樣品,于 50 mL離心管中,加入30 mL提取液,于 60℃下酶解,振蕩提取 24 h,4 000 r/min離心5 min,收集上清液,用乙酸緩沖液定容到50 mL,待測(cè)定。

1.2.4 樣品檢測(cè)

準(zhǔn)確移取 1.2.4得到的酶解液 0.1 mL,放于10 mL容量瓶中,加入1 mL亞甲基藍(lán)溶液,用磷酸緩沖液定容至刻度,在564 nm波長(zhǎng)下測(cè)定各溶液吸光值,通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到溶液中多糖濃度,按照下式計(jì)算樣品中海參酸性黏多糖的含量。

式中,X為樣品中酸性黏多糖含量(%);C為樣品中測(cè)定的酸性黏多糖濃度;V為樣品溶液定容體積;W為樣品測(cè)試取樣體積;M為取樣質(zhì)量;10為測(cè)定溶液定容體積。

1.3 海參酸性黏多糖經(jīng)酸水解后液相色譜測(cè)定的色譜條件

Eclipse XDB-C18柱 250 mm×4.6 mm,5μm;柱溫：30℃;流速：1.0 mL/min,紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：250 nm;進(jìn)樣體積：10 μL;流動(dòng)相：溶劑 A,15%(V/V)乙腈+50 mmol/L磷酸緩沖液(KH2PO4-NaOH,pH 6.0),溶劑B,40%(V/V)乙腈+50 mmol/L磷酸緩沖液(KH2PO4-NaOH,pH 6.0);二元梯度洗脫程序：時(shí)間梯度0→9 min→15 min,相應(yīng)的濃度梯度為100%→90%→45% (溶劑 A)。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法原理

亞甲基藍(lán)是一種醌亞胺類陽(yáng)離子染色劑,在酸性介質(zhì)中,亞甲基藍(lán)的雜環(huán)氮原子因質(zhì)子化而帶正電以陽(yáng)離子狀態(tài)存在[7],因此能夠與負(fù)離子親水膠體相互作用,形成可溶于水的異染變色配合物,這個(gè)配合物導(dǎo)致染料顏色發(fā)生變化,從藍(lán)色(最大吸收波長(zhǎng) 610～664nm)到紫色(最大吸收波長(zhǎng) 520～560nm)。海參多糖是由巖藻糖等單糖和有機(jī)硫酸酯組成的線性聚陰離子高分子,在酸性介質(zhì)中,以陰離子狀態(tài)存在,與亞甲基藍(lán)可發(fā)生特異性異染現(xiàn)象,由于亞甲基藍(lán)和聚陰離子間的相互作用是可逆的,且二者之間的結(jié)合比率為1：1[8],因此可依據(jù)此原理建立海參酸性黏多糖含量測(cè)定的亞甲基藍(lán)顯色分光光度法。

2.2 異染配合物最大吸收波長(zhǎng)的確定

通過(guò)圖1中 A可以看出,亞甲基藍(lán)水溶液在608 nm和664 nm處有明顯吸收峰,當(dāng)加入不同濃度的酸性黏多糖標(biāo)液后(圖B、C和D),564 nm處的吸光值隨著多糖濃度的增加,呈現(xiàn)明顯增大的趨勢(shì),而 608 nm和664 nm處吸收值呈現(xiàn)明顯減少的趨勢(shì)。這說(shuō)明海參酸性黏多糖與亞甲基藍(lán)發(fā)生了特異性異染效應(yīng),生成了一種易溶于水的異染變色配合物,而564 nm正是該異染變色配合物的最大吸收峰,這與Soedjak等[9]報(bào)道的結(jié)果基本相同,因此可以根據(jù)不同濃度酸性黏多糖與次甲基藍(lán)異染后配合物最大吸收波長(zhǎng)吸光度值的變化來(lái)對(duì)樣品中多糖含量進(jìn)行測(cè)定。

2.3 樣品水解方式的選擇

目前多糖的提取主要采用酶水解[10]和酸水解方式(6 mol/L鹽酸于105℃充氮封管水解4 h),實(shí)驗(yàn)中分別采用兩種水解方式對(duì)樣品進(jìn)行處理,并利用分光光度法進(jìn)行多糖樣品含量測(cè)定。

圖1 不同濃度標(biāo)液與亞甲基藍(lán)異染后吸光值變化趨勢(shì)Fig.1 Changes of absorptions during the mixing of standard solutions and methylene blue

通過(guò)圖2可以看出,采用酸水解得到的樣品與亞甲基藍(lán)呈色反應(yīng)后,經(jīng)分光光度計(jì)測(cè)得的吸光值要明顯低于采用酶水解的樣品,這主要是由于實(shí)驗(yàn)中采用的是木瓜蛋白酶,該酶專一性水解蛋白,而對(duì)于其他多糖類物質(zhì)沒有切除作用,因此溶液中剩余的糖類物質(zhì)是以多糖大分子的形式存在,當(dāng)加入充足的亞甲基藍(lán)后,多糖大分子與其發(fā)生異染反應(yīng),生成了在564 nm處有最大吸收的異染配合物。當(dāng)采用酸水解時(shí),由于鹽酸的水解無(wú)選擇性,致使樣品中的多糖被部分水解,經(jīng)高效液相色譜法測(cè)定酸水解產(chǎn)物中含有巖藻糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖等單糖及葡萄糖醛酸(圖3),分別將巖藻糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖與亞甲基藍(lán)染料進(jìn)行混合反應(yīng),并采用分光光度法測(cè)定其吸光值,發(fā)現(xiàn)添加各單糖后樣品吸光值與空白樣品無(wú)異,而葡萄糖醛酸其含量過(guò)低(按面積歸一化法測(cè)定含量約為 3.5%)因此對(duì)吸光度值的影響可以忽略,由此可以推斷以上幾種單糖不能與亞甲基藍(lán)染料發(fā)生異染效應(yīng),所以經(jīng)過(guò)酸水解后樣品中能夠與亞甲基藍(lán)產(chǎn)生配合物的物質(zhì)比酶水解的樣品中減少,相應(yīng)地其在564 nm處吸光值也就發(fā)生了降低,這也就與圖1得到的結(jié)果相吻合。通過(guò)酸性黏多糖水解方式的討論可以發(fā)現(xiàn),蛋白酶水解對(duì)于亞甲基藍(lán)分光光度法最適用的。

圖2 不同水解方式對(duì)樣品吸光值影響Fig.2 Effects of different ways of hydrolysis on the absorption values of the reaction products

圖3 海參酸性黏多糖經(jīng)酸水解產(chǎn)物色譜圖Fig.3 Chromatogram of hydrolysis products of mucopolysaeccharide

2.4 線性范圍

在本實(shí)驗(yàn)條件下,配制濃度為0～20 mg/L的系列海參多糖標(biāo)準(zhǔn)液,以吸光值為縱坐標(biāo),樣品多糖濃度為橫坐標(biāo),得到線性回歸方程為：y=0.031x-0.0144,相關(guān)系數(shù)大于0.99,線性良好。

2.5 顯色劑用量的確定

當(dāng)樣品中多糖含量過(guò)高(本試驗(yàn)中高于20 mg/L)時(shí),亞甲基藍(lán)用量不足,會(huì)導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果偏低,反之,當(dāng)亞甲基藍(lán)用量過(guò)高(本實(shí)驗(yàn)中高于 1.0 mL)時(shí),由于其具有顯色干擾作用,也會(huì)導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果偏低。通過(guò)改變亞甲基藍(lán)用量測(cè)定酸性黏多糖含量的結(jié)果表明,當(dāng)濃度為0.4 mmol/L的亞甲基藍(lán)用量為1.0 mL時(shí),該體系的吸光值變化最大,且穩(wěn)定性良好,本實(shí)驗(yàn)選擇亞甲基藍(lán)用量為1.0 mL。

2.6 顯色反應(yīng)時(shí)間的確定

在分光光度法測(cè)定實(shí)驗(yàn)中,呈色反應(yīng)的時(shí)間很有可能是影響測(cè)定結(jié)果的關(guān)鍵因素,本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)濃縮凍干海參多糖樣品的吸光值隨時(shí)間變化情況進(jìn)行測(cè)定,得到如圖4結(jié)果。

從圖4可以看出,該顯色反應(yīng)在50 min內(nèi)吸光值的變化范圍在 0.00～0.02之間,沒有明顯的下降趨勢(shì),這說(shuō)明50 min內(nèi)該顯色反應(yīng)穩(wěn)定性持續(xù)良好;延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間,溶液的吸光值呈現(xiàn)明顯的下降趨勢(shì),此時(shí)溶液中逐漸析出顆粒狀沉淀,且隨著時(shí)間的延長(zhǎng),沉淀越來(lái)越多,溶液的吸光值明顯降低,此時(shí)顯色反應(yīng)已經(jīng)發(fā)生質(zhì)的變化,不再適宜進(jìn)行吸光值測(cè)定?？紤]到顯色反應(yīng)的穩(wěn)定性,本實(shí)驗(yàn)選擇在30 min內(nèi)對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)試。

2.7 檢測(cè)限

用分光光度法檢測(cè)樣品,以扣除空白值(未加標(biāo)準(zhǔn)的空白參比液吸光值為空白值)后的吸光值為0.01相對(duì)應(yīng)的濃度值為檢測(cè)限,即檢出限L=(標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量×0.01)/(標(biāo)準(zhǔn)吸光值-空白吸光值)[11]。采用此方法得到樣品中海參酸性黏多糖的最低檢出濃度為：0.79 mg/L。

圖4 海參多糖樣品吸光值與反應(yīng)時(shí)間關(guān)系Fig.4 Reaction kinetics

2.8 回收率試驗(yàn)

向已知多糖含量的樣品中加入一定量多糖標(biāo)準(zhǔn)溶液,測(cè)定結(jié)果之差與加入多糖量之比即為回收率。

通過(guò)對(duì)測(cè)定方法的回收率考察發(fā)現(xiàn),分別以海參三個(gè)組織樣品為基底,添加不同水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí),其回收率在78.33%～100.09%范圍內(nèi),能夠滿足測(cè)定要求(表1)。

2.9 不同組織多糖含量測(cè)定及方法精密度

通過(guò)表2的分析可以發(fā)現(xiàn),海參體壁中酸性黏多糖含量最高,大約占總量的 4.751%,其次是海參卵,最少的是海參腸,這次實(shí)驗(yàn)結(jié)果也說(shuō)明了酸性黏多糖不僅在海參體壁中含有,在其他部位也有相當(dāng)可觀的含量,因此在工業(yè)生產(chǎn)中可充分利用海參內(nèi)臟中資源進(jìn)行酸性黏多糖的提取加工。同時(shí)通過(guò)表2可以發(fā)現(xiàn),通過(guò)對(duì)三個(gè)組織樣品進(jìn)行的5次重復(fù)測(cè)定,結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于 10%,這說(shuō)明該方法的精密度符合要求。

3 結(jié)論

(1)本實(shí)驗(yàn)依據(jù)亞甲基藍(lán)與海參酸性黏多糖反應(yīng)能夠產(chǎn)生異染配合物的特性,建立了海參酸性黏多糖含量測(cè)定的分光光度法,對(duì)顯色劑用量以及反應(yīng)時(shí)間等因素進(jìn)行了探討,確定了最佳的顯色反應(yīng)條件。實(shí)驗(yàn)中對(duì)該方法的檢測(cè)限、回收率以及精密度都進(jìn)行了測(cè)定,使該方法更科學(xué)完善。

(2)對(duì)海參中經(jīng)濟(jì)價(jià)值比較高的腸、卵以及體壁等部位進(jìn)行了分別收集,并利用建立的方法對(duì)各部位中酸性黏多糖含量進(jìn)行測(cè)定,最終發(fā)現(xiàn)海參體壁中多糖含量最高,海參卵次之,海參腸中多糖含量最少,這一測(cè)定結(jié)果,為海參酸性黏多糖工業(yè)化生產(chǎn)改進(jìn)也提供了數(shù)據(jù)支持。

(3)針對(duì)不同水解方式對(duì)多糖含量測(cè)定結(jié)果的影響進(jìn)行了探討,最終發(fā)現(xiàn)采用木瓜蛋白酶水解的方法比采用酸水解方法更適合于分光光度法的測(cè)定。

表1 測(cè)定方法的回收率Tab.1 Recoveries of spiking experiments

表2 樣品測(cè)定及精密度Tab.2 Measurement and precision

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