(集美大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院,水產(chǎn)生物技術(shù)研究所,福建 廈門 361021)

羊鮑(Haliotis ovina)屬鮑科。其殼與肉皆可入藥,且肉質(zhì)細(xì)嫩、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高,是中國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)鮑類之一。羊鮑在中國(guó)主要出產(chǎn)于海南及西沙群島海域。近年來由于酷漁濫捕及海區(qū)生境不斷惡化等原因,羊鮑的自然資源受到嚴(yán)重破壞,這對(duì)原本就不大的羊鮑天然捕獲量來說猶如雪上加霜。對(duì)羊鮑自然資源的保護(hù)已經(jīng)刻不容緩。而對(duì)于羊鮑遺傳背景的深入了解是制定科學(xué)有效的保護(hù)措施的必要前提。關(guān)于羊鮑遺傳學(xué)方面的研究已有相關(guān)報(bào)道[1-4],但迄今尚未發(fā)現(xiàn)采用隨機(jī)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性 DNA 標(biāo)記(RAPD)技術(shù),對(duì)產(chǎn)于中國(guó)的羊鮑野生群體進(jìn)行遺傳多樣性分析的報(bào)道。

RAPD標(biāo)記技術(shù)誕生于1990年,由于其具有操作簡(jiǎn)單、成本低廉且無需專門設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物等特點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于遺傳圖譜的構(gòu)建、基因定位、遺傳多樣性分析、物種或品種鑒定、親緣關(guān)系確定及良種選育等諸多遺傳學(xué)研究領(lǐng)域[5-9]。在經(jīng)濟(jì)貝類的群體遺傳學(xué)分析方面,RAPD技術(shù)已成功運(yùn)用于縊蟶(Sinonovacula constricta)、皺紋盤鮑(Haliotis discus hannai)、雜色鮑(Haliotis diversicolorReeve)、大連灣牡蠣(Crassostrea talienwhanensis)、馬氏珠母貝(Pinctada martensii)、文蛤(Meretrix meretrix)等物種的研究[10-15]。表明 RAPD技術(shù)既能夠獲得足夠多的分子標(biāo)記來用于分析不同群體的遺傳多樣性,又可通過數(shù)據(jù)處理來判斷不同群體間的遺傳分化程度[13]。

本研究采用 RAPD技術(shù),對(duì)中國(guó)羊鮑野生群體的遺傳多樣性與遺傳分化進(jìn)行分析探討,以期為中國(guó)羊鮑種質(zhì)資源的保護(hù)、自然資源的可持續(xù)利用及良種選育提供科學(xué)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)所用野生羊鮑分別采自中國(guó)海南省的英州、安游及亞龍灣,每個(gè)群體隨機(jī)取樣 30個(gè),取得的新鮮樣品加冰保存,運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室后放入-40℃冰箱保存至分析。

1.2 基因組DAN的制備

DNA提取主要參照傳統(tǒng)的酚/氯仿抽提法,略做修改。具體步驟如下：每個(gè)個(gè)體取足部肌肉組織50～100 mg,剪碎放入1.5 mL離心管中。加入700 μL由 2×CTAB(10 mmol/L Tris-HCl,pH8.0;0.5 mol/L EDTA,pH8.0;1.4 mol/L NaCl;0.02 g/mLCTAB),0.2 μL β-2 巰基乙醇及 15μL 蛋白酶 K(20 g/L)組成的CTAB消化液于振蕩器上振蕩均勻,55℃消化過夜。待肌肉組織完全消化后加入 700 μL氯仿 ：異戊醇(24 ：1)混合液,顛倒混勻15 min,離心 10 min(12 000 r/min)。離心后吸取上清液至另一個(gè)新管。再加入600 μL 苯酚 ：氯仿 ：異戊醇(25 ：24 ：1)混合液進(jìn)行抽提,提取后的上清液再加入 600 μL 氯仿 ：異戊醇(24 ：1)混合液抽提一次,加入 800 μL經(jīng)-20℃預(yù)冷的異丙醇,顛倒混勻,-20℃存放 2 h后離心 10 min(10 000 r/min),產(chǎn)生白色沉淀,棄上層液體,保留離心管底部沉淀,再先后用經(jīng)-20℃預(yù)冷的 1mL70%與1mL 100%的乙醇緩慢顛倒洗滌 DNA沉淀,各自離心 10min(10 000 r/min),棄上層液,保留沉淀。將DNA樣品置于空氣中晾干;干燥后的 DNA樣品加入100 μL ddH2O,放入4℃冰箱充分溶解。用0.8%瓊脂糖電泳檢測(cè)溶解后的DNA的質(zhì)量。

1.3 RAPD擴(kuò)增反應(yīng)

RAPD反應(yīng)條件參照Williams 等的方法[16]。反應(yīng)總體積為 25 μL,其中 1×Buffer 2.5 μL,MgCl2(25 mmol/L)2.5 μL,dNTP(2.5 mmol/L)1 μL,Taq 酶(5U/μL)0.3μL,引物(5 mg/L)3μL,模板 DNA 50 ng,其余的部分用ddH2O補(bǔ)足。于PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件：首先經(jīng)94℃預(yù)變性4 min,后進(jìn)入45個(gè)PCR循環(huán)：即94℃變性1min,35℃退火1min,72℃延伸1min。最后再經(jīng)72℃繼續(xù)延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用2.0%瓊脂糖凝膠電泳分離,EB染色,紫外投射儀檢測(cè)并拍照記錄。

1.4 數(shù)據(jù)處理

對(duì)電泳后凝膠上清晰可見的擴(kuò)增條帶進(jìn)行記錄,在同一遷移位置有帶的記為“1”,無帶則記為“0”,列出“0”,“1”矩陣,輸入統(tǒng)計(jì)軟件 POPGENE 1.32 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,獲得羊鮑 3個(gè)群體的多態(tài)位點(diǎn)百分?jǐn)?shù)(P)、Shannon’s 信息指數(shù)(I)、Nei’s 基因多樣性指數(shù)(H)、群體間的遺傳距離(D)、群體間基因分化系數(shù)(GST)等遺傳學(xué)參數(shù)。并由程序 NEIGHBOR中的 Neighborjoining構(gòu)建羊鮑3個(gè)群體的聚類分析圖。

2 結(jié)果

2.1 引物篩選與RAPD擴(kuò)增結(jié)果

本研究采用40個(gè)隨機(jī)引物進(jìn)行RAPD擴(kuò)增實(shí)驗(yàn),從中優(yōu)化出14個(gè)能擴(kuò)增出清晰條帶、并可重復(fù)的有效引物(表1,引物S97對(duì)3個(gè)羊鮑野生群體的RAPD擴(kuò)增圖譜見圖1)。用這14個(gè)引物在羊鮑3個(gè)野生群體 90個(gè)個(gè)體中共檢測(cè)到72個(gè)位點(diǎn)。其中英州群體的多態(tài)位點(diǎn)數(shù)最多為65個(gè),安游和亞龍灣群體的多態(tài)位點(diǎn)數(shù)則分別為61和62個(gè)。

表1 14個(gè)多態(tài)隨機(jī)引物的DNA序列及其擴(kuò)增結(jié)果Tab.1 Sequences and amplification results of 14 random primers

圖1 引物S97對(duì)3個(gè)羊鮑野生群體的RAPD擴(kuò)增圖譜Fig.1 RAPD amplification bands of three H.ovina stocks with primer S97

2.2 遺傳多樣性

羊鮑 3個(gè)野生群體的多態(tài)位點(diǎn)百分?jǐn)?shù)(P)為84.72%～90.28%,平均為 87.04%;Shannon’s信息指數(shù)(I)為 0.400～0.456,平均為 0.433;Nei’s 基因多樣性指數(shù)(H)為0.262～0.305,平均為0.286 (詳見表2)。

2.3 遺傳分化與聚類分析

羊鮑3個(gè)野生群體間的遺傳距離(D)為0.0504～0.0731。其中英州群體與安游群體之間的遺傳距離最大為 0.0731,英州群體與亞龍灣群體的遺傳距離最小為 0.0504,而安游群體與亞龍灣群體的遺傳距離居中為 0.0577。群體間的遺傳分化系數(shù)(GST)為0.0976。根據(jù)各群體間的遺傳距離應(yīng)用 NJ法得到 3個(gè)群體的聚類分析圖(圖2)。

表2 羊鮑3個(gè)群體的遺傳多樣性參數(shù)Tab.2 Indexes of genetic diversity of three H.ovina stocks by RAPD

圖2 用NJ法得到的羊鮑3個(gè)野生群體的聚類分析圖樹Fig.2 NJ cluster analysis dendrogram of three H.ovina stocks

3 討論

遺傳多樣性是生物多樣性的核心與基礎(chǔ),是生物種群內(nèi)和種群間可遺傳的變異。種群遺傳變異的重要性在于它能夠使進(jìn)化的變化得以發(fā)生,而這些變化的速率與現(xiàn)有的遺傳多樣性的數(shù)量成正比[17]。遺傳變異作為物種自身生存和未來進(jìn)化的資源,不但能夠給種群帶來適合度方面的優(yōu)勢(shì),而且同樣有利于人工育種。多態(tài)位點(diǎn)百分?jǐn)?shù)(P)、Shannon’s信息指數(shù)(I)、Nei’s基因多樣性指數(shù)是群體遺傳多樣性度量的主要參數(shù)。在本研究中,3個(gè)羊鮑野生群體的多態(tài)位點(diǎn)百分?jǐn)?shù)(P)為 87.04%,Shannon’s信息指數(shù)(I)為0.433,Nei’s基因多樣性指數(shù)(H)為0.286。將此結(jié)果與同樣采用 RAPD技術(shù)所獲得的一些經(jīng)濟(jì)貝類野生群體的遺傳多樣性參數(shù)均值進(jìn)行比較,羊鮑群體的遺傳多樣性與文蛤(P= 86.5%,H=0.1935)[15]、櫛孔扇貝(Chlamys farreri)(P= 85.46%,I=0.243)[18]、西施舌(Coelomactra antiquata)(P=78.97%,I=0.349,H=0.309)[19]等物種的遺傳多樣性相當(dāng);遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于大珠母貝(Pinctada maxima)(P= 50.0%,I=0.1170)[20]、皺紋盤鮑(P=50.0%,I=0.258)[21]等物種的遺傳多樣性;而僅略低于青蛤(Cyclina sinensis)(P= 92.07%,I=0.558,H=0.377)[22]的遺傳多樣性。由此可以判斷,羊鮑在海洋經(jīng)濟(jì)貝類中具有較高的遺傳多樣性水平,種質(zhì)資源狀況良好。這一結(jié)論與采用 AFLP技術(shù)所獲得的研究結(jié)果一致[4]。根據(jù)以往的研究報(bào)道,在經(jīng)過幾個(gè)世代的人工養(yǎng)殖后,物種的遺傳多樣性會(huì)有所降低[23-25],羊鮑雖為中國(guó)的經(jīng)濟(jì)鮑類之一,但至今未開展大規(guī)模的人工養(yǎng)殖,這就避免了羊鮑養(yǎng)殖群體對(duì)野生群體的遺傳污染,從而間接地保護(hù)了羊鮑自然群體的遺傳多樣性。

Nei[26]認(rèn)為群體間遺傳分化系數(shù)GST的值可以從0到1,當(dāng)各群體間幾乎沒有分化時(shí),GST的值接近0,因?yàn)楦魅后w的所有等位基因頻率幾乎相同。在本研究中,羊鮑群體間的遺傳分化系數(shù)GST為0.0976,顯示其中90.24%的遺傳分化存在于群體之內(nèi),9.76%的遺傳分化存在于群體之間,因此羊鮑的群體內(nèi)變異為主要變異,群體間的遺傳分化較小。遺傳距離是判斷遺傳變異的另一尺度。本研究的 3個(gè)羊鮑群體間的遺傳距離介于0.0504～0.0731之間,遠(yuǎn)小于大珠母貝[20]、馬氏珠母貝[14]等物種群體間的遺傳距離,而與文蛤[15]、縊蟶[10]等物種群體間的遺傳距離相當(dāng)。物種分化實(shí)際上是生物自身對(duì)異質(zhì)化環(huán)境適應(yīng)的結(jié)果。對(duì)于水產(chǎn)動(dòng)物來說,發(fā)生遺傳分化的原因主要包括地理隔離與水文狀況差異以及人工干涉等[12-14]。具體到本研究的羊鮑群體來說,三個(gè)群體的采集地之間的地理距離較小,水文狀況差異不大。此外,雖然羊鮑為營(yíng)附著生活的貝類,成體的活動(dòng)范圍較小,但在羊鮑的生活史中,有營(yíng)浮游生活的幼體階段,這就為群體之間發(fā)生基因交流創(chuàng)造了可能。劉必謙等[13]也認(rèn)為,雖然對(duì)于貝類來說,基因流動(dòng)的范圍是有限的,但由于進(jìn)化是一個(gè)漫長(zhǎng)的過程,在此過程中相距不遠(yuǎn)的群體之間的基因也有可能慢慢擴(kuò)散,從而降低了各群體間的遺傳差異。從本研究的聚類分析結(jié)果來看,英州群體與亞龍灣群體之間的親緣關(guān)系相對(duì)較近,而亞龍灣群體與安游群體之間的親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn),這可能是由于安游群體與亞龍灣群體的采集地點(diǎn)都是較為封閉的海灣,從而在一定程度上阻礙了兩群體之間的基因交流所致。

一般認(rèn)為,RAPD技術(shù)的多態(tài)性檢測(cè)程度要高于等位酶技術(shù)。這是因?yàn)閺睦碚撋现v等位酶技術(shù)只能分析部分功能基因(外顯子)的情況,而對(duì)其余部分的基因無法分析,而 RAPD技術(shù)可以分析研究對(duì)象的整個(gè)基因組的情況,從而能夠獲得更多的遺傳信息。在本次采用RAPD技術(shù)的研究中3個(gè)羊鮑野生群體的多態(tài)位點(diǎn)百分?jǐn)?shù)(84.72%～90.28%),遠(yuǎn)高于采用等位酶技術(shù)獲得的 3個(gè)羊鮑野生群體的多態(tài)位點(diǎn)百分?jǐn)?shù)(27.27%～54.55%)[2],這一比較結(jié)果再次驗(yàn)證了上述理論。很多實(shí)驗(yàn)證實(shí),RAPD標(biāo)記在單位分析中(每引物或引物對(duì))檢測(cè)到的多態(tài)位點(diǎn)數(shù)顯著低于AFLP標(biāo)記[27-28]。而從本研究中可以看出,優(yōu)化較多數(shù)量的引物用于實(shí)驗(yàn)檢測(cè),便能獲得足夠的用于分析的分子標(biāo)記,從而彌補(bǔ) RAPD標(biāo)記在該方面的不足。雖然影響RAPD反應(yīng)的因素較多,但如果在實(shí)驗(yàn)中采用標(biāo)準(zhǔn)化的反應(yīng)條件,注重個(gè)體之間、群體之間實(shí)驗(yàn)操作的同步性與對(duì)比性,保證DNA的提取、濃度檢測(cè)及PCR反應(yīng)各成分的一致性和電泳條件的統(tǒng)一性,并通過多次重復(fù)反應(yīng),就可以獲得穩(wěn)定而真實(shí)的實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果。此次 RAPD技術(shù)的分析結(jié)果與之前的 AFLP分析在羊鮑 3個(gè)群體的遺傳多樣性水平、群體間的遺傳分化程度的判斷及群體間的聚類分析結(jié)果等都顯示出高度的一致性[4]。由此不難看出,RAPD分析技術(shù)在遺傳學(xué)研究領(lǐng)域仍不失為一種簡(jiǎn)便有效的分子標(biāo)記。

[1]Klinbunga S,Pripue P,KhamnamtongN,et al.Genetic diversity and molecular markers of the tropical abalone(Haliotis asinina)in Thailand[J].Mar Biotechnol,2003,5：505-517.

[2]Li Z B.The genetic diversity and differentiation ofH.ovinapopulations by allozyme analysis[C]//13th International Congress on Genes,Gene Families and Isozymes-ICGGFI.Bologna：Medimond,2006：201-207.

[3]黎中寶,Appleyard Sharon A,Elliott Nicholas G.羊鮑(Haliotis ovina)和耳鮑(H.asinina)MtDNACOⅠ和COⅡ基因片段序列的比較研究[J].海洋與湖沼,2008,39(2)：168-173.

[4]Li Z B.The genetic diversity and differentiation ofHaliotis ovinaby AFLP [C]//2009 International Conference on Environmental Science and Information Application Technology.Hong Kong：Engineering Technology Press,2009：7：39-42.

[5]Bassam B J,Castano-Anolles G.DNA amplification fingerprinting of bacteria[J].Appl Microbiol Biotech,1992,77：321-341.

[6]Comincini S,Sironi M,Bandi C,et al.RAPD analysis of systematic relationships among the Cerridae[J].Heredity,1996,76：215-221.

[7]Wilkie S E,Isaac P G,Slater R J.Random amplified polymorphic DNA (RAPD) markers for genetic analysis inAllium[J].Thero Appl Genet,1993,86：497-504.

[8]黎中寶．應(yīng)用RAPD技術(shù)研究4種鮑的親緣關(guān)系[J].中國(guó)生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2004,12(4)：60-63．

[9]謝浩,陸仁后,項(xiàng)超美,等.利用 RAPD技術(shù)對(duì)三種絨螯蟹親緣關(guān)系的研究[J].水生生物學(xué)報(bào),1999,23(2)：120-126.

[10]李成華,李太武,宋林生,等．4個(gè)縊蟶群體遺傳結(jié)構(gòu)的RAPD分析[J].水產(chǎn)科學(xué),2004,23(12)：26-28．

[11]陳靜,劉志剛,王偉,等.馬氏珠母貝 4種殼色選育系 RAPD反應(yīng)體系優(yōu)化[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué).2009,16(3)：1-4.

[12]李太武,楊文新,宋林生,等．皺紋盤鮑(Haliotis discus hannai Ino)和雜色鮑(Haliotis diversicolorReeve)遺多樣性的研究[J]．海洋與湖沼,2003,34(4)：445-448．

[13]劉必謙,戴繼勛,喻子牛．RAPD標(biāo)記在大連灣牡蠣種群研究中的應(yīng)用[J]．青島海洋大學(xué)學(xué)報(bào),1998,28(1)：82-87．

[14]王愛民,閻冰,葉力,等．三個(gè)野生種群馬氏珠母貝遺傳多樣性的 RAPD分析[J]．農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào),2003,11(2)：163-168．

[15]閻冰,鄧岳文,杜曉東,等．廣西地區(qū)文蛤的遺傳多樣性研究[J]．海洋科學(xué),2002,26(5)：5-7．

[16]Williams J G K,Kubelik A R,Livak J,et al.DNA polymorphisms identified by arbitrary primers are useful as genetic markers[J].Nucleic AcidsRes,1990,18(22)：6 531-6 535.

[17]克里施納默西K V.生物多樣性教程[M]．張正旺,主譯.北京：化學(xué)工業(yè)出版社,2006：9-10．

[18]劉亞軍,孔曉瑜,喻子牛．櫛孔扇貝(Chlamys farreri)自然群體遺傳多樣性的RAPD分析[J]．海洋與湖沼,2006,37(4)：289-295．

[19]尤仲杰,包永波,張愛菊．中國(guó)沿海西施舌5個(gè)自然群體形態(tài)差異和 RAPD分析[J]．海洋學(xué)報(bào),2007,29(3)：99-103．

[20]蘇天鳳,朱彩艷,江世貴.海南島大珠母貝遺傳多樣性分析[J]．海洋科學(xué),2005,29(8)：20-22．

[21]李莉,常林瑞,孫振興,等．皺紋盤鮑遺傳多樣性的RAPD 分析[J]．海洋水產(chǎn)研究,2006,27(1)：59-63．

[22]白胡木吉力圖,高悅勉,姚紅偉．青蛤北方3個(gè)群體遺傳多樣性分析[J]．水產(chǎn)科學(xué),2008,27(9)：487-489．

[23]宋林生,李俊強(qiáng),李紅蕾,等.用 RAPD技術(shù)對(duì)中國(guó)櫛孔扇貝野生種群與養(yǎng)殖群體的遺傳結(jié)構(gòu)及其遺傳分化的研究[J].高技術(shù)通訊,2002,7：83-86.

[24]方展強(qiáng),陳軍,鄭文彪,等.鱖野生群體與養(yǎng)殖群體的RAPD 分析[J]．大連水產(chǎn)學(xué)院學(xué)報(bào),2005,20(1)：16-19.

[25]宋林生,相建海,李晨曦,等.日本對(duì)蝦野生種群與養(yǎng)殖種群遺傳結(jié)構(gòu)的 RAPD標(biāo)記研究[J]．海洋與湖沼,1999,30(3)：261-266.

[26]Nei M.F-statistics and analysis of gene diversity in subdivided populations[J].Ann Human Genet,1977,41：225-233.

[27]Thierry M L,Panaud O,Toupance B,et al.Assessment of genetic relationships betweenSetaria italicaandits wild relativeS.viridisusing AFLP markers[J]．Theor Appl Genet,2000,100：1 061-1 066.

[28]Nakajima Y,Oeda K,Yamamoto T.Characterization of genetic diversity of nuclear and mitochondrial genomes inDaucusvarieties by RAPD and AFLP[J]．Plant Cell Reports,1998,17：848-853.