段東霞

(1.海洋腐蝕與防護國防科技重點實驗室,山東 青島 266001; 2.中國船舶重工集團公司第七二五所 青島分部,山東 青島 266001)

生物污損(biofouling)是指生物在材料表面附著生長并造成危害的現(xiàn)象,根據(jù)附著生物類型可將生物污損分為微生物污損(microfouling)和大型生物污損(macrofouling)。微生物污損主要指細(xì)菌等微生物在材料表面附著并形成生物膜(biofilm)的現(xiàn)象。對于海洋工程材料,生物污損不僅涉及細(xì)菌等的附著,同時也包含藤壺、牡蠣等大型海洋生物的附著,后者稱為大型生物污損。

微生物污損會加速金屬材料腐蝕[1]、非金屬材料的降解[2-3],降低構(gòu)件的使用性能和安全性能,降低冷卻管路的冷卻效率,在醫(yī)療行業(yè)會導(dǎo)致人員感染患病,食品腐敗等; 宏觀生物污損會增加船舶動力消耗、降低航行速度,影響艦船的機動性和戰(zhàn)斗性能的發(fā)揮[4],因而控制生物污損對國民經(jīng)濟和國防安全都非常重要。傳統(tǒng)的防污方法主要通過使用有毒物質(zhì)殺滅污損生物發(fā)揮防污作用,常用的包括施加殺菌劑和使用氧化亞銅防污涂料等,但隨著抗藥菌的出現(xiàn)及世界各國環(huán)保意識的增強,發(fā)展長效環(huán)保防污材料已經(jīng)成為各國的研究重點。

不同于傳統(tǒng)防污材料,環(huán)保型防污材料主要通過改變材料表面結(jié)構(gòu)、物理化學(xué)性質(zhì)及尋找環(huán)境友好的高效生物防污劑達到抑制污損生物附著,減少污損危害的目的。酶能夠在溫和條件下高效地催化化學(xué)反應(yīng),且自身在環(huán)境中容易降解,對環(huán)境沒有危害,因而酶作為一種潛在的防污材料被廣泛研究。本文結(jié)合污損生物附著機理,綜述了酶在防污領(lǐng)域的最新研究進展。

1 典型污損生物的附著機理

生物污損過程大致分為 4個階段：第一個階段是蛋白質(zhì)、多糖等可溶性有機碳(Dissolved organic carbon,DOC)在材料表面吸附形成條件膜; 第二個階段是細(xì)菌等原核微生物的附著和生物膜(biofilm)的形成; 第三個階段是真菌、藻類等生物的附著; 最后是大型污損生物藤壺、牡蠣、貽貝等的附著。諸多研究結(jié)果表明生物污損發(fā)展的前一階段對后續(xù)階段生物的附著有重要影響：條件膜的形成不僅改變材料表面的物理化學(xué)性質(zhì),也影響后期細(xì)菌、微藻等的附著[5-7]; 生物膜在材料表面的形成情況及性質(zhì)決定了后續(xù)大型生物的附著情況[8-11]。若前期生物膜演替過程被阻止則后續(xù)大型生物,特別是硬殼生物的附著將被阻止,因此對材料表面初期微生物污損進行防控不僅能夠避免生物膜帶來的危害,而且能夠防止大型污損生物的附著。

1.1 細(xì)菌

生物膜是細(xì)菌生長過程中為適應(yīng)生存環(huán)境而在固體表面上生長的一種與浮游狀態(tài)相對應(yīng)的存在形式。

生物膜廣泛分布水環(huán)境中,它的形成經(jīng)歷了三個階段：首先是細(xì)菌通過疏水性作用、靜電作用力等在材料表面形成初始附著; 隨后細(xì)菌通過其表面的蛋白樣成分與材料表面的受體形成特異性的吸附;最后細(xì)菌與細(xì)菌之間相互聚集,形成生物膜。

生物膜中 97%以上的含量是水,除了水和細(xì)菌外,生物膜中還包括胞外多聚物(Extracellular poly-meric substance,EPS)、吸附的營養(yǎng)物質(zhì)及細(xì)菌裂解產(chǎn)物等,因此生物膜中存在各種主要的生物大分子如蛋白質(zhì)、多糖、DNA、RNA、肽聚糖、磷脂等物質(zhì)[12]。細(xì)菌濃度、菌齡、表面鞭毛、菌毛等附加結(jié)構(gòu)、環(huán)境溫度、流體力學(xué)、營養(yǎng)物種類與濃度、材料表面的物理化學(xué)性質(zhì)等都影響細(xì)菌生物膜的形成。細(xì)菌到達物體表面時,其合成 EPS的某些基因被激活,細(xì)菌大量分泌產(chǎn)生胞外多聚物。EPS是形成生物膜的重要物質(zhì),它由多聚糖、蛋白質(zhì)、核酸、糖蛋白、磷脂等構(gòu)成。

不同細(xì)菌 EPS的多糖組分差異很大,既可以是簡單的均一多糖,也可以是復(fù)雜的非均一多糖,分子質(zhì)量從 103～108kDa不等,主要由中性己糖、6-脫氧己糖、多元醇、糖醛酸和氨基糖構(gòu)成。均一多糖主要由中性己糖,一般為 D-葡聚糖構(gòu)成。非均一多糖通常是由雙糖至八糖形成的規(guī)則重復(fù)單位構(gòu)成,而這些重復(fù)單位則是由 2～4種單糖所組成,其中許多糖被乙?；鶊F所修飾[13]。

除多糖外,胞外多聚物中的另一個重要組分是蛋白質(zhì)。生物膜中的蛋白質(zhì)對膜結(jié)構(gòu)有重要影響。雖然不同細(xì)菌形成的生物膜中蛋白質(zhì)組分差異非常大,但是在不同細(xì)菌的生物膜中都發(fā)現(xiàn)了葡萄球菌BAP蛋白的同系物,該蛋白對于形成生物膜結(jié)構(gòu)非常重要[14]。另外,多種細(xì)菌生物膜的蛋白質(zhì)中都含有GGDEF和 EAL(GlyGlyAspGluPhe/GluAlaLeu)序列,這些蛋白在調(diào)整胞外多糖分泌中具有重要作用[14,15]。

生物膜的細(xì)菌間并不是孤立存在的,細(xì)胞與細(xì)胞之間通過群體感應(yīng)信號分子(Quorum sensing,QS)相互交流,QS能幫助細(xì)菌判斷環(huán)境中同類細(xì)菌的數(shù)量,決定自身的生長、基因表達等。

1.2 微藻

海洋微藻具有種類多、數(shù)量大的特點,其中底棲硅藻是一種典型的污損微藻。硅藻的附著過程包括到達表面后的隨機著陸、初始附著、滑行及永久附著四個步驟。硅藻的初始附著和永久附著都依賴于EPS的分泌。EPS直接關(guān)系到生物膜的形成、垂直結(jié)構(gòu)和硅藻棲息地的穩(wěn)定。硅藻的胞外多糖各不相同,主要是糖醛和含硫的酸性多糖和蛋白糖,通常它們由戊糖、己糖、脫氧己糖、甲氧基和氨基己糖通過糖苷鍵連接形成的重復(fù)序列構(gòu)成。不同硅藻分泌的多糖在單元組成和糖苷鍵鏈接上都存在很大差異。雖然硅藻 EPS的組成非常復(fù)雜,不過學(xué)者們利用二級離子飛行時間質(zhì)譜發(fā)現(xiàn)Cylindrotheca closterium,Navicula mutica和Nitzschiacf.brevissima的胞外多糖具有相同的結(jié)構(gòu)片段[18]。盡管目前尚未明確硅藻EPS中的何種成分(包括多糖、糖蛋白和蛋白糖等)主導(dǎo)硅藻細(xì)胞的附著過程,但相關(guān)研究已取得了一定進展。Wang等[19]發(fā)現(xiàn)抑制胞外多糖合成的藥物2,6-二氯苯甲氰及其類似物能可逆地阻止長柄曲殼藻的附著和滑行,并導(dǎo)致柄狀 EPS永久附著結(jié)構(gòu)無法形成。Lind等[20]研究表明硅藻胞外蛋白糖調(diào)節(jié)主要依靠蛋白糖中的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)部分。

1.3 大型污損生物

大型污損生物主要包括藤壺、貽貝和巨型海藻等,它們在附著過程中具有相似性,都是以浮游階段的孢子或幼蟲形式附著在材料表面,然后發(fā)育成熟為產(chǎn)生嚴(yán)重危害的污損生物。

藤壺是常見的甲殼類動物,也是主要的污損生物。藤壺在整個生命周期中經(jīng)歷了營浮游生活的無節(jié)幼蟲期和腺介幼蟲期及固著生活時期。藤壺在腺介蟲幼蟲期尋找合適的基底材料附著、變態(tài),在這一過程中向體外分泌膠質(zhì)——醌-丹寧蛋白質(zhì)。藤壺分泌的初生膠是透明的、無黏性流體,在6 h內(nèi)通過鍵合作用逐漸聚合成不透明的“橡膠塊”。在形成穩(wěn)定的化學(xué)鍵前,膠質(zhì)借助于表面細(xì)微結(jié)構(gòu),吸收或排水以利于對基材的成功黏接與材料表面形成交聯(lián)膜。膠質(zhì)與基材的實際黏接有時間依賴性,隨時間的增長,黏結(jié)力有一個漸近增長[21]。

藤壺膠質(zhì)主要含有分子質(zhì)量分別為100,68,52,20kDa的蛋白質(zhì),并依次命名為 CP-100K,CP-68K,CP-52K,CP-20K。其中CP-100K和CP-52K是膠質(zhì)的主要組分,他們不溶于水,主要通過二硫鍵和疏水作用相互聚合在一起。CP-68K溶于水,該組分對于藤壺幼蟲附著的影響不大。CP-20K在藤壺膠質(zhì)中雖然所占含量不高,但卻具有重要作用,該組分約含有 17.5% Gly,11.5% Asp,10.4% Glu,10.4% His。研究發(fā)現(xiàn)該組分中含有大量半胱氨酸殘基,但是分子之間卻沒有二硫鍵,只在分子內(nèi)部發(fā)現(xiàn)了二硫鍵[22,23]。

貽貝也是沿岸和近海中較普遍的一種生物,在分類地位上屬于軟體動物門,瓣鰓綱。貽貝的足絲腺能分泌足絲使其附著在材料表面。足絲由膠原腺和輔助腺分泌的蛋白質(zhì)類物質(zhì)組成。蛋白質(zhì)主要為多酚蛋白質(zhì)。富含賴氨酸的多酚蛋白質(zhì)與黏液腺分泌的富含硫酸鹽的黏多糖能在基材表面置換水。實驗表明貽貝的實際黏接聚合物是多酚蛋白?；瘜W(xué)作用鍵主要包括氫鍵,多酚蛋白的賴氨酸與生物膜黏液中的硫酸基團形成的離子鍵,及多酚蛋白與細(xì)菌膜酸性聚合物之間形成的離子鍵。足絲的產(chǎn)生受溫度、鹽度、流速和貽貝的年齡等因素的影響[21]。貽貝足絲中主要含有5種蛋白質(zhì),其中組分Mefp 1研究的最清楚。Mefp 1含有75～80個六肽和十肽重復(fù)單元構(gòu)成的線性序列。Ala-Lys-Pro-Ser-Tyr-Dhp-Hyp-Thr-DOPA-Lys是最常見的重復(fù)序列,重復(fù)單元中很多殘基被羥基化和二羥基化。Mefp 1中酪氨酸經(jīng)羥基化后形成苯丙氨酸(DOPA)。Mefp 2和Mefp 4是構(gòu)成足絲的主要蛋白,這兩種蛋白中DOPA的含量較低。Mefp3、Mefp5在剛分泌的足絲液體中含量較高,這兩種組分中含有較高含量的 DOPA,其中Mefp 5中的DOPA殘基很快與賴氨酸反應(yīng)形成連接[21,23-24]。

孔石莼作為大型海藻的代表在污損生物中具有代表性。孢子的附著和細(xì)菌的附著過程相似,都有初始附著和永久附著兩個階段,當(dāng)孔石莼孢子黏附在材料表面時,孢子會產(chǎn)生大量糖蛋白。

藤壺、貽貝和大型海藻分泌的蛋白質(zhì)中都含有豐富的賴氨酸,這決定了大型污損生物的膠質(zhì)具有類似的等電點。另外,這些蛋白質(zhì)中絲氨酸和甘氨酸的含量也很高,這就造成大型海洋生物的膠黏蛋白在構(gòu)象上具有彈性。除藤壺膠黏劑之外,其他大型生物的膠質(zhì)中都含有大量苯丙氨酸,苯丙氨酸被生物體中的酶氧化成苯丙氨酸-醌后可以與其他氨基酸進一步發(fā)生交聯(lián),使得膠黏蛋白固化[25]。

表1中列出了主要污損生物膠黏劑的化學(xué)性質(zhì),從表中可知大部分污損生物,特別是大型污損生物膠質(zhì)的主要成分蛋白質(zhì)。

表1 主要污損生物膠黏劑成分一覽表

大型污損生物在材料表面的附著受材料表面微觀結(jié)構(gòu)、光照情況、流體動力學(xué)和基底材料性質(zhì)影響,同時也受材料表面生物膜的影響。一些種類的海洋細(xì)菌可以促進大型生物的附著,另外一些菌種則對相同的海洋生物附著有抑制作用。生物膜的這種作用在藤壺、多毛環(huán)蟲、貽貝、扇貝、苔蘚蟲、海星、海鞘、鮑魚、海參、孔石莼中都有發(fā)現(xiàn)。生物膜對大型污損生物的附著可解釋為生物膜中的微生物產(chǎn)生了對大型海洋生物附著不利的代謝產(chǎn)物。目前發(fā)現(xiàn)的由微生物產(chǎn)生的防污活性物質(zhì)包括8-泛醌,類生物堿物質(zhì)等[4]。Dobretsov[26]在生物膜對苔蘚蟲附著影響的研究過程中發(fā)現(xiàn)若生物膜中的微生物能夠產(chǎn)生蛋白酶,則該生物膜對苔蘚蟲的附著有抑制作用,相反對藤壺幼蟲附著有促進作用的生物膜中則不含蛋白酶。

2 酶的特性

酶是由生物細(xì)胞產(chǎn)生的,具有催化能力的生物催化劑。除少數(shù)為核酸外,絕大多數(shù)酶的本質(zhì)為蛋白質(zhì)。作為生物催化劑,酶對催化的底物有高度的選擇性,往往只能催化一種或一類反應(yīng)。根據(jù)各種酶所催化的化學(xué)反應(yīng)類型可把酶分為6大類,即水解酶、氧化還原酶類、轉(zhuǎn)移酶、裂合酶、異構(gòu)酶和連接酶。

生物細(xì)胞產(chǎn)生的酶有兩類,一類是由細(xì)胞產(chǎn)生分泌到細(xì)胞外進行作用的酶,即胞外酶,這類酶大多數(shù)是水解酶類。另一類酶在細(xì)胞內(nèi)合成后并不分泌到細(xì)胞外,而是在細(xì)胞內(nèi)起催化作用,稱為胞內(nèi)酶。

根據(jù)酶大多數(shù)屬于蛋白質(zhì)這一特性,用一系列分離蛋白質(zhì)的方法可以進行酶的分離純化,例如鹽析、等電點沉淀、有機溶劑分級及選擇性熱變性等方法可用于酶的粗分離。粗酶可利用層析、高效液相及電泳方法進一步純化。一般而言,胞外酶壁胞內(nèi)酶更易于分離純化。

3 酶在防污中的應(yīng)用

在各種類型的酶中,水解酶的防污研究最為廣泛。水解酶能夠催化脂鍵、糖苷鍵、醚鍵、肽鍵、酸苷鍵及其他C-N鍵共11個亞類的水解反應(yīng),常見的有蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等。水解酶主要通過四個途徑實現(xiàn)其防污作用：(1)分解生物膜中的高分子聚合物,主要是EPS; (2)分解生物信息交換的群感效應(yīng)信號分子; (3)直接分解污損生物分泌并用于附著的膠質(zhì); (4)促進材料中防污物質(zhì)的釋放。

3.1 酶在微生物污損防治中的應(yīng)用

幾乎所有的細(xì)菌在一定條件下都可以形成生物膜,造成微生物污損。水解酶通過降解生物膜中的EPS和群感效應(yīng)信號分子實現(xiàn)防涂生物膜目的。

因為生物膜的主要成分是多糖、蛋白質(zhì)等生物大分子,它們對細(xì)菌、硅藻的附著產(chǎn)生重要影響。因而分解糖和蛋白質(zhì)的水解酶就可能具有控制生物膜的作用,這一猜測已被很多研究所證實。Yannick等[27-31]研究了多種商業(yè)化的水解酶對細(xì)菌生物膜的清除效果。研究結(jié)果表明,水解酶對生物膜的清除效果受水解酶性質(zhì)和生物膜中細(xì)菌的種類影響。在所研究的糖酶(淀粉酶、纖維素酶、半纖維素酶、葡聚糖酶、幾丁質(zhì)酶、殼聚糖酶等)、蛋白酶(枯草桿菌蛋白酶,木瓜蛋白酶等)和脂肪酶中,蛋白酶和糖酶的防污效果較好,其余水解酶的防污效果一般,甚至?xí)ι锬さ男纬善鸫龠M作用。絲氨酸蛋白酶對生物膜的清除具有廣譜性[27],不僅對多種單一細(xì)菌的生物膜有很好的去除效果[29],對混合細(xì)菌的生物膜也有很好的去除效果[31]。水解酶對生物膜的清除效果受環(huán)境pH影響,在堿性緩沖液中水解酶能夠清除更多種細(xì)菌的生物膜,清除率也更高。利用添加了表面活性劑的溶液溶解酶,并進行適當(dāng)?shù)姆稚?、螯合后生物膜的去除效果更好[29]。水解酶不僅能很好地預(yù)防生物的形成,也能有效地清除材料表面已形成的生物膜。水解酶對生物膜的分解和抑制作用,不受添加時間的影響。水解酶對生物膜的防除作用主要是通過分解生物膜內(nèi)大分子起作用,而不是通過抑制細(xì)菌的呼吸即殺滅細(xì)菌細(xì)胞本身起作用[27]。 糖酶對細(xì)菌[27]和硅藻[32-33]的作用在大多數(shù)情況下不如絲氨酸蛋白酶,這主要是因為生物膜中胞外多糖結(jié)構(gòu)復(fù)雜多變,很難找到對多種細(xì)菌和硅藻的胞外多糖起作用的糖酶。

群感效應(yīng)信號分子在生物膜形成過程中具有重要作用。革蘭氏陰性菌的群感效應(yīng)分子 N-?；呓z氨酸內(nèi)酯類物質(zhì)(acyl-homoserine lactone,AHL)是快速形成生物膜的基礎(chǔ)。近來,科學(xué)家已經(jīng)發(fā)現(xiàn)能夠水解AHL酰胺鍵的酰胺酶,該酶對生物膜的形成有抑制作用[34]。另外,因為高濃度的AHL能夠促進石莼孢子和多毛環(huán)蟲幼蟲的附著[35],因而可以推斷酰胺酶也能夠抑制大型生物污損。

3.2 酶對大型污損生物的防污作用

目前全球已知的大型污損生物共有4 000多種,我國海域的污損生物有 600多種,其中主要包括海藻、藤壺、苔蘚蟲、海綿、水螅等。污損生物主要附著在船舶的水下部位、水線區(qū)、螺旋槳和海水管系等,可引起艦船表面粗糙度增加、自重增大、航行阻力增大、航速減慢、燃料消耗增多,造成艦船進塢維修頻率增多,嚴(yán)重影響艦船在航率和使用壽命,而且污損生物還會阻塞海水管道、干擾聲納信號、造成材料結(jié)構(gòu)損壞,嚴(yán)重影響艦船戰(zhàn)斗力的發(fā)揮。

Pettitt[33]研究了包括脂肪酶、纖維素酶、葡萄糖淀粉酶、混合酶等24種酶的防污效果。其中絲氨酸蛋白酶(Alcalase)在防止綠藻孢子和藤壺幼蟲附著方面具有最佳效果。Nick Aldred利用原子力顯微鏡研究了絲氨酸蛋白酶 Alcalase對藤壺(Balanus amphitrite)膠質(zhì)的分解作用,結(jié)果顯示蛋白酶作用 600～1 400 s后,膠質(zhì)的黏附力從340 pN降至150 pN,隨后附著力直線降至 0。蛋白酶 Alcalase作用 26 min后藤壺幼蟲分泌的膠質(zhì)就可被完全分解。研究還發(fā)現(xiàn)蛋白酶對藤壺幼蟲的活動如游動速度(velocity)、移動距離(distance moved)、移動角度(turn angel)都沒有影響。不過與微生物污損不同,水解酶對已經(jīng)固化的藤壺膠質(zhì)沒有分解作用[35]。

4 酶在防污應(yīng)用中需要解決的問題

酶應(yīng)用于防污有兩大優(yōu)點：第一,很多酶已經(jīng)實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)且廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、洗滌劑等行業(yè);第二,酶在海水中12天內(nèi)即被完全分解為氨基酸并進一步分解為水和二氧化碳,所以酶作為防污材料不會額外增加環(huán)境負(fù)擔(dān)。目前很多廉價的酶制劑已經(jīng)表現(xiàn)出較好的防污效果且以絲氨酸蛋白酶為代表的水解酶具有較好的廣譜性,不僅能清除材料表面的生物膜而且對藤壺膠質(zhì)有很強的分解作用,因而酶作為防污材料表現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。當(dāng)然我們也應(yīng)看到酶作為防污材料若要獲得實際應(yīng)用還要攻克很多技術(shù)難題。首先要解決酶在涂料中活性的長期保持問題。酶作為工業(yè)化產(chǎn)品,一般都比較穩(wěn)定,具有較長的保質(zhì)期。但是涂料作為一種復(fù)雜的有機體系會對酶產(chǎn)生多種影響,甚至?xí)?dǎo)致酶失活,所以選擇與防污酶相匹配的涂料體系,同時采用多種技術(shù)手段增強酶在涂料中的穩(wěn)定性就成為目前科研工作者的研究重點。Tasso等[36]已成功將絲氨酸蛋白酶Subtilisin A接枝到馬來酸酐樹脂上并形成了涂料,實驗結(jié)果顯示酶經(jīng)處理后防污效果顯著提高。另外,對水解酶的篩選和進一步復(fù)配是一個長期工程,除了對商業(yè)化生產(chǎn)的酶進行防污效能評價,篩選出有防污應(yīng)用前景的酶外,還應(yīng)注意開發(fā)新的適于海洋環(huán)境和涂料體系的防污用酶。

5 展望

利用酶作為防污材料為我們提供了一種新的生物污損防除方法,它的應(yīng)用適應(yīng)了目前環(huán)保型防污材料的需求,并推動了對污損生物生態(tài)、附著機理及防除等各個方面研究的深入。水解酶特別是絲氨酸蛋白酶表現(xiàn)出的良好防污效果,已經(jīng)引起各國科研機構(gòu)及相關(guān)生產(chǎn)廠商的重視,紛紛投入巨資開發(fā)酶防污涂料。例如丹麥的 Biolocus公司已開發(fā)出多種應(yīng)用與海洋防污的酶制劑并與JOTUN公司合作生產(chǎn)了酶涂料。該種涂料已在快艇上推廣應(yīng)用。GENECORE公司和 HEMPEL公司合作開發(fā)了基于己糖酶和過氧化氫酶聯(lián)合生產(chǎn)過氧化氫進行防污的防污涂料。我國酶防污材料的研究還處于起步階段,與國外的差距比較大。鑒于酶作為防污材料具有容易實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)、防污效果佳且對環(huán)境友好等特點,所以有必要加大酶作為防污材料的研究力度。

[1]Little B,Wagner P,Mansfeld F.Microbiologically influenced corrosion of metals and alloys[J].International Materials Reviews,1992,36(6)：253-272.

[2]Legonkova O A,Selitskaya O V.Microbiological destruction of composite polymeric materials in soils[J].Eurasian Soil Science,2009,42(1)：62-68.

[3]Ji-Dong Gu.Microbiological deterioration and degradation of synthetic polymeric materials：recent research advances[J].International Biodeterioration & Biodegradation,2003,52(2)：69-91.

[4]方芳,嚴(yán)濤,劉慶.化學(xué)生態(tài)學(xué)在海洋污損生物防除中的應(yīng)用[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報,2005,16(10)：1997-2002.

[5]Wahl M.Marine epibiosis.I.Fouling and antifouling-some basic aspects[J].Marine Ecology Progress Series,1989,58(12)：175-189.

[6]Schneider R P,Chadwick B R,Pembrey R,et al.Retention of the Gram-negative bacterium Sw8 on surfaces under conditions relevant to the subsurface environment effects of conditioning films and substratum[J].FEMS Microbiology Ecology,1994,14(3)：243-254.

[7]Jain A,Bhosle NB.Biochemical composition of the marine conditioning film：implications for bacterial adhesion[J].Biofouling,2009,(25)：13-19.

[8]Maki J S,Rittschof D,Costlow J D,et al.Inhibition of attachment of larval barnacles,Balanus amphitrite,by bacterial surface-films[J].Marine Biology,1988,97(2)：199-206.

[9]Holmstr?m C,Kjelleberg S.MarinePseudoalteromonasspecies are associated with higher organisms and produce biologically active extracellular agents[J].FEMS Microbiology Ecology,1999,30(4)：285-293.

[10]Tait K,Joint I,Daykin M,et al.Disruption of quorum sensing in seawater abolishes attraction of zoospores of the green alga Ulva to bacterial biofilms[J].Enviromental Microbiology,2005,7(2)：229-240.

[11]Zardus J D,Nedved B T,Huang Y,et al.Microbial biofilms facilitate adhesion in biofouling invertebrates[J].the Biological Bulletin,2008,214 (1)：91-98.

[12]Sutherland I W.The biofilm matrix - an immobilized but dynamic microbial environment[J].Trends in Microbiology,2001,9(5)：222-227.

[13]李江,陳靠山,郝林華,等.細(xì)菌胞外多糖的研究進展[J].海洋科學(xué),2006,30(4)：74-77.

[14]Lasa I.Towards the identification of the common features of bacterial biofilm development[J].International Microbiology,2006,9(1)：21-28.

[15]Latasa C,Solano C,Penadés J R,et al.Biofilm-associated proteins[J].Comptes Rendus Biologies,2006,329：849-857.

[16]Poulsen N C,Spector I,Spurck T P,et a1.Diatom gliding is the result of an actin—myosin motility system[J].Cell Motility Cytoskel,1999,44(1)：23-33。

[17]Holland R,Dugdale T,Wetherbee R,et al.Adhesion and motility of fouling diatoms on a silicone elastomer[J].Biofouling,2004,20(6)：323-329.

[18]Brouwer J F C,Cooksey K E,Wigglesworth-Cooksey B,et al.Time of flight-secondary ion mass spectrometry on isolated extracellular fractions and intact biofilms of three species of benthic diatoms[J].Journal of Microbiological Methods,2006,65：562-572.

[19]Wang Y,Lu J,Mollet J C,et al.Extracelluar matrix assembly in diatoms (Bacillariophyceae) II.2.6- dichlorobenzonitrile inhibition of motility and stalk production in the marine diatomAchnanthes longipes[J].Plant Physiology,1997,113(4)：1071-1080.

[20]Lind J L,Heimann K,Miller E A,et al.Substratum adhesion and gliding in a diatom are mediated by extracellular proteoglycans[J].Planta,1997,203(2)：213-221.

[21]宋永香,王志政.海洋生物及其黏附機理——藤壺、帽貝、海葵、管棲蠕蟲[J].中國膠黏劑,2003,12(4)：60-63.

[22]Aldred N,Clare S A.The adhesive strategies of cyprids and development of barnacle-resistant marine coatings[J].Biofouling,2008,24(5)：351-363

[23]Wiegemann M.Adhesion in blue mussels (Mytilus edulis) and barnacles (genus Balanus)：mechanisms and technical adaptations[J].Aquatic Science,2005,67(2)：166-176.

[24]Sagert J,Sun C,Waite J H.Chemical subtleties of mussel and polychaete holdfasts[C].Smith A M,Callow J A.Biological Adhesives.Berlin Heidelberg：Springer Verlag,2006.

[25]Callow J A,Stanley M S,Wetherbee R,et al.Cellular and molecular approaches to understanding primary adhesion in Enteromorpha：an overview[J].Biofouling,2000,16(2)：141-150.

[26]Dobretsov S,Xiong H,Xu Y,et al.Novel antifoulants：inhibition of larval attachment by proteases[J].Marine Biotechnology,2007,9：388-397.

[27]Johansen C,Falholt P,Gram L.Enzymatic removal and disinfection of bacterial biofilms[J].Applied Environmental Microbiology,1997,63(9)：3724-3728.

[28]Xavier J B,Picioreanu C,Rani S A,et al.Biofilmcontrol strategies based on enzymic disruption of the extracellular polymeric substance matrix- a modelling study[J].Microbiology,2005,12(151)：3817-3832.

[29]Yannick L,Gauthier B,Martine C,et al.Using enzymes to remove biofilms of bacterial isolates sampled in the food-industry[J].Biofouling,2010,26(4)：421-431

[30]Leroy C,Delbarre C,Ghillebaert F,et al.Effects of commercial enzymes on the adhesion of a marine biofilm-forming bacterium[J].Biofouling,2008,24(1)：11-22.

[31]Hangler M,Burm?lle M,Schneider I B,et al.The serine protease Esperase HPF inhibits the formation of multispecies biofilm[J].Biofouling,2009,25(7)：667-674.

[32]Chiovitti A,Higgins M J,Harper R E,et al.The complex polysaccharides of the raphid diatomPinnularia viridis(Bacillariophyceae) [J].Journal of Phycology,2003,39：543-554.

[33]Pettitt M,Henry S,Callow J,et al.Activity of commercial enzymes on settlement and adhesion of cypris larvae of the barnacle Balanus amphitrite,spores of the green algaUlva linza,and the diatomNavicula perminuta[J].Biofouling,2004; 20(6)：299-311.

[34]Zhang L H,Lin Y H,Xu J L.Ralstonia AHL-acylase gene,WO/2003/068951,2003-08-21.

[35]Huang S,Hadfield M G.Composition and density of bacterial biofilms determine larval settlement of the polychaete Hydroides elegans[J].Marine Ecology Progress Series,2003,260：161-172.

[36]Tasso M,Pettitt M E,Cordeiro AL,et al.Antifouling potential of Subtilisin A immobilized onto maleic anhydride copolymer thin films[J].Biofouling,2009,25(6)：505-516.