李興偉 薛 白* 王之盛 徐世曉 王基恒 李占鋒

(1.四川農(nóng)業(yè)大學動物營養(yǎng)研究所，雅安 625001;2.中國科學院西北高原生物研究所，西寧 810000)

近年來由于蛋白質(zhì)飼料價格上漲，反芻動物養(yǎng)殖成本也在逐年升高，而利用尿素等非蛋白含氮化合物(NPN)替代反芻動物飼糧中的蛋白質(zhì)飼料原料對緩解這一狀況效果明顯［1］。但尿素在瘤胃微生物脲酶的作用下水解快，氨的釋放速度往往超過瘤胃微生物的利用速度，造成相當數(shù)量的氨進入血液。當血液氨濃度超過肝臟的解毒能力時，就會引起動物機體氨中毒。因此，實際生產(chǎn)中尿素的應用在很大程度上受到限制。農(nóng)業(yè)廢棄物如蔗渣、玉米秸稈、玉米芯、花生及燕麥殼聚戊糖含量豐富，水解加熱時聚戊糖形成羰基，羰基與尿素反應形成緩釋性氮源［2］，從而改善含尿素飼糧的適口性，減緩尿素釋氨速度，降低瘤胃內(nèi)游離氨的濃度，防止氨中毒的發(fā)生。Higgns等［3］利用紫花苜蓿、玉米和酰胺溶液(尿素、縮二脲及甲酰胺)在催化劑作用下產(chǎn)生多糖類的酰胺化合物，施用于反芻動物，提高了非蛋白含氮化合物的利用效率;梁致遠等［2］用玉米芯作基質(zhì)，添加尿素，在硫酸溶液作催化劑情況下，96%尿素與羰類結(jié)合，這類化合物可以在瘤胃內(nèi)平緩的釋放氨氮(NH3-N)，減少反芻動物氨中毒。本試驗是在前人研究的基礎(chǔ)上結(jié)合以往纖維質(zhì)類材料制作緩釋尿素的經(jīng)驗，化學合成了1種新型的緩釋尿素產(chǎn)品——羰氨縮合尿素(carbonyl-am ino urea，CAU)，擬首先利用體外培養(yǎng)技術(shù)研究CAU釋放NH3-N的速度，而后進一步利用藏羊為動物模型，分別采用豆粕(SBM)、磷酸脲(UP)和CAU配制3種等能等氮飼糧，綜合評價CAU的營養(yǎng)價值，為CAU在反芻動物飼養(yǎng)中的有效利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與試驗設(shè)計

1.1.1 CAU釋氨速度的評定(體外法)

用體外培養(yǎng)技術(shù)，通過與UP和SBM的釋氨速度進行比較，評定CAU的釋氨速度。本試驗設(shè)置2個對照組和1個試驗組，每組各設(shè)6個重復，對照組為SBM組和UP組，試驗組為CAU組，按照所加各試劑等能等氮的原則，分別稱取SBM、UP 和 CAU(200 ±1.0)mg、(102.7 ±1.0)mg 和(150.6±1.0)mg放入100 m L的注射器中，并向UP組和CAU組中加入淀粉(190.3±1.0)mg平衡能量。采集瘤胃液，按 Menke等［4］方法進行體外發(fā)酵試驗。分別在體外培養(yǎng) 1、2、4、6、8、10、14、18、24 h后終止發(fā)酵，測定培養(yǎng)液中NH3-N濃度。瘤胃液采自3頭體況良好、體重相近［(25.00±2.00)kg］，安裝有永久性瘤胃瘺管的藏羊。

1.1.2 動物試驗(體內(nèi)法)

本試驗主要用于評定CAU對藏羊瘤胃發(fā)酵和血清生化指標的影響。選擇3頭體況良好、體重相近［(25.00 ±2.00)kg］，安裝有永久性瘤胃瘺管藏羊作為試驗動物。采用3×3拉丁方試驗設(shè)計，通過比較CAU飼糧、SBM飼糧和UP飼糧對藏羊瘤胃發(fā)酵和血清生化指標的影響，綜合評價CAU的營養(yǎng)價值。試驗分3期進行，每期預試期11 d，正試期2 d，全期共39 d。在體內(nèi)試驗正試期的第1天，于08:00在動物頸靜脈采集10 m L血液樣品。在正試期的第2天，分別于08:00(食前1 h)、10:00(食后 1 h)、11:00(食后 2 h)、13:00(食后4 h)、15:00(食后 6 h)、17:00(食后8 h)、19:00(食后10 h)、23:00(食后 14 h)和第 2天03:00(食后18 h)、09:00(進食后 24 h)，用瘤胃液抽慮裝置通過瘺管采集瘤胃液約100 m L，注入離心管，用以測定瘤胃液中pH、NH3-N和微生物蛋白(MCP)。

1.2 試驗材料

自主研發(fā)的CAU。CAU的營養(yǎng)成分見表1。

表1 羰氨縮合尿素的營養(yǎng)成分(風干基礎(chǔ))Table 1 The nutrients of carbonyl-am ino urea(air-dry basis) %

1.3 試驗飼糧與飼養(yǎng)管理

試驗飼糧配制參照我國肉羊飼養(yǎng)標準(2004)。試驗分3個組，SBM組飼喂SBM飼糧，UP組飼喂 UP(粗蛋白質(zhì)含量為75.41%)飼糧，CAU組飼喂CAU飼糧。試驗飼糧組成及營養(yǎng)水平見表2。試驗動物單圈飼養(yǎng)，每日09:00飼喂1次(先喂精料，后喂粗料)，自由飲水。

1.4 試驗指標的測定及樣品的處理和分析

1.4.1 血清生化指標的測定

血液樣品在4 000 r/m in下離心10 m in，分離血清，分裝于EP管中，于－20℃的冰箱中保存?zhèn)溆?。采用日本島津全自動生化分析儀對血清中尿素氮(BUN)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)進行測定，試劑盒購自成都邁克試劑有限公司。

1.4.2 NH3-N 濃度的測定

取10 m L瘤胃液在4 000 r/m in下離心10 m in，量取 0.5 m L 上清液，保存在 1.5 m L 的EP管內(nèi)，然后放于－20℃冰箱內(nèi)冷凍保存。采用馮宗慈等［5］的改進法，用分光光度法測定上清液中NH3-N濃度。

1.4.3 pH 的測定

在各時間點發(fā)酵終止后，用Sartorius PB－20型pH計測定瘤胃液不同時間點的pH。測定前，pH計先用與待測培養(yǎng)液pH接近的緩沖液(pH=6.86)進行定位，而后再用pH為4.00的緩沖液調(diào)整斜率，反復調(diào)整后，用于樣品測定。

表2 試驗飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎(chǔ))Table 2 Composition and nutrient levels of experimental diets(air-dry basis) %

1.4.4 MCP 的測定

取瘤胃液 8 m L，4℃ 20 000 r/m in離心20 m in，去上清液。采用Zinn等［6］的嘌呤法，以酵母RNA作為標準品，使用紫外分光光度計在260 nm波長下測定各樣品的MCP含量。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理

采用Excel軟件整理數(shù)據(jù)，用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件中的GLM模型進行方差分析，均值的多重比較采用Duncan氏法進行。

2 結(jié)果

2.1 體外培養(yǎng)技術(shù)評定CAU釋氨速度

由表3可知，在1～24 h內(nèi)，CAU組和UP組的NH3-N濃度變化規(guī)律都為先升后降，而SBM組則呈緩慢上升趨勢。CAU組在8 h以前各時間點的NH3-N濃度均低于UP組，高于SBM組;8 h NH3-N濃度達到最大值(42.76 mg/dL)，此時低于 UP 組 11.27%(P ＜0.01)，高于 SBM 組44.08%(P ＜0.01);8 h之后高于 UP 組和 SBM組，直到24 h與UP組持平，低于 SBM組(P＜0.01)。而 UP組 在 2 h便 達 到 最 大 值(54.44 mg/dL)，SBM 組則在 24 h出現(xiàn)最大值(45.28 mg/dL)。另外，CAU組的NH3-N濃度從2～24 h時 間 段 內(nèi) 保 持 穩(wěn) 定，在33.91～42.76 mg/dL范圍內(nèi)波動，而其他2組的波動范圍都大于此。

2.2 CAU對藏羊瘤胃液pH的影響

由表4可知，在24 h時間內(nèi)，3組瘤胃液pH變化規(guī)律相近，飼喂前瘤胃pH最高，采食后pH逐漸下降，并且都在食后6 h pH達到最低值，且差異不顯著(P＞0.05)，而后又逐漸上升。CAU組、UP組、SBM組的 pH變化范圍分別是6.18～6.89、6.19 ～6.94、6.11 ～6.92。

2.3 CAU對藏羊瘤胃液NH 3-N濃度的影響

由表5可以看出，在24 h內(nèi)，3組瘤胃液NH3-N濃度變化規(guī)律相近，都呈“高－低－高”的變化趨勢，并且都在進食后2 h達到最大值。在2 h時，CAU組瘤胃液NH3-N濃度低于UP組(P＜0.01)，高于 SBM 組(P ＜0.05)。CAU 組、UP 組和SBM組3個組的NH3-N濃度變化范圍分別是:10.84 ～ 16.60 mg/dL、10.64 ～ 19.26 mg/dL 和10.92 ～14.56 mg/dL。

表3 各處理不同時間點的NH 3-N濃度Table 3 The change of NH3-N concentration in each treatmentw ith extension of time mg/dL

表4 羰氨縮合尿素對藏羊瘤胃液pH的影響Table 4 Effects of CAU on rum inal fluid pH in Tibetan sheep

2.4 CAU對藏羊瘤胃液MCP含量的影響

由表6可知，在采食后1～2 h，CAU組與UP組的MCP含量均顯著高于SBM 組(P＜0.01);在采食后10 h，CAU組藏羊瘤胃液MCP的含量達到最大值，此時比UP組和 SBM組分別高4.39%(P ＞0.05)和 27.24%(P ＜0.01);綜合來看，24 h內(nèi)CAU組藏羊瘤胃液MCP的含量平均為17.25 mg/dL，高于 UP 組3.01%，高于 SBM 組30.45% 。

2.5 CAU對藏羊血清生化指標的影響

由表7可以看出，各組間藏羊血清中ALB、TP、BUN的含量，GOT和GPT活性均無顯著差異(P ＞0.05)。

表5 羰氨縮合尿素對藏羊瘤胃液NH 3-N濃度的影響Table 5 Effects of CAU on rum inal fluid NH3-N concentration in Tibetan sheep mg/dL

表6 羰氨縮合尿素對藏羊瘤胃液MCP含量的影響Table 6 Effects of CAU on rum inal fluid MCP concentration in Tibetan sheep mg/dL

3 討論

3.1 體外法評定CAU的釋氨速度

NH3-N是飼料蛋白質(zhì)和內(nèi)外源尿素分解的終產(chǎn)物，又是微生物合成蛋白質(zhì)的原料。NH3-N的濃度直接影響MCP的產(chǎn)量［7］。由表3可以看出，CAU組在8 h以前各時間點的NH3-N濃度均低于UP組，高于 SBM 組;24 h與 UP組持平，低于SBM組，且NH3-N濃度在2～24 h時內(nèi)的變化范圍更小，說明與UP組和SBM組相比，CAU組釋氨速度更為平穩(wěn)。李靜等［8］研究表明，尿素及其衍生物飼料級縮二脲在體外短期人工瘤胃模擬培養(yǎng)4 h，尿素與飼料級縮二脲NH3-N濃度均呈逐漸升高趨勢，尿素與飼料級縮二脲NH3-N濃度在0.5～4 h 時的變化范圍分別為20.91 ～91.12 mg/dL和 21.76 ～56.56 mg/dL，并指出飼料級縮二脲釋氨程度與速度顯著小于尿素，而本研究CAU組氨氮濃度在前4 h的變化范圍為11.60～38.12 mg/dL，釋氨程度與速度小于飼料級縮二脲及尿素。由此可以看出，羰氨縮合尿素釋氨速度大幅度降低，可長時間平緩的為瘤胃微生物生長提供氮源。

3.2 CAU對藏羊瘤胃液pH的影響

瘤胃pH是反映瘤胃發(fā)酵水平最基本、最重要的指標之一，對維持瘤胃內(nèi)環(huán)境相對恒定起到主導作用［9］。瘤胃pH直接受唾液分泌、揮發(fā)性脂肪酸(VFA)及其他有機酸生成、吸收和排出等因素的影響［10］，其波動的根本原因取決于飼糧結(jié)構(gòu)和營養(yǎng)水平［11］。李靜等［8］以尿素和飼料級縮二脲飼糧飼喂西門塔爾牛，飼料級縮二脲飼糧的瘤胃pH在6.57～6.91范圍內(nèi)波動，而本研究3組飼糧對藏羊瘤胃pH的影響規(guī)律十分相似，均在采食后開始下降，6 h降到最低，然后又逐漸升高。UP組和CAU組僅在2、4及6 h高于 SBM 組，CAU組、UP組及SBM組的pH變化范圍分別是6.18～6.89、6.19 ～ 6.94、6.11 ～ 6.92，均在瘤胃正常pH 范圍(5.5 ～7.5)內(nèi)。

3.3 CAU對藏羊瘤胃液NH 3-N濃度的影響

Hart等［12］報道反芻動物體內(nèi)瘤胃微生物生長的適宜NH3-N 濃度范圍為6.3～27.5 mg/dL，本研究中各組瘤胃NH3-N濃度都在此范圍內(nèi)。本試驗3個組NH3-N濃度變化趨勢與前人研究一致［13－14］，在 24 h 時間內(nèi)，各組瘤胃液 NH3-N 濃度在2 h達到最大值后，UP組和SBM組均在8 h時降到最低，而CAU組則在14 h降到最低;2～14 h范圍內(nèi)，CAU組的NH3-N濃度波動范圍小于UP組，高于SBM組，表明CAU組釋氨速度較之UP組適中且平穩(wěn)，與體外培養(yǎng)的結(jié)果一致。李靜等［8］用體內(nèi)法研究飼料級縮二脲的有效性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)尿素組與飼料級縮二脲組NH3-N濃度變化趨勢一致，2組的NH3-N濃度變化范圍分別為8.63 ～34.63 mg/dL和 9.67 ～23.17 mg/dL，并指出飼料級縮二脲較尿素更有利于氨利用效率的提高和安全性的提升，本研究CAU組NH3-N濃度波動范圍明顯低于尿素與飼料級縮二脲，結(jié)合體外法可知CAU作為一種飼料級非蛋白含氮化合物，其氨利用效率更高，安全性更可靠。

3.4 CAU對藏羊瘤胃液MCP合成的影響

瘤胃微生物是反芻動物蛋白質(zhì)營養(yǎng)的重要組成部分，可為畜主提供所需要蛋白質(zhì)的40%～60%［15］。反芻動物瘤胃微生物生長率是影響機體營養(yǎng)代謝狀況和生產(chǎn)水平發(fā)揮的重要因素。本試驗研究中，在前10 h CAU組的瘤胃液MCP含量增長速度高于其他2組，3組均在10 h達到最大值，且10 h之后CAU組的濃度降低速度低于其他2組;從整體來看，在24 h內(nèi)CAU組藏羊瘤胃液MCP含量平均為17.25 mg/dL，高于其他2組。結(jié)合各組NH3-N濃度變化范圍與MCP含量可以看出，CAU組和SBM組MCP含量在2 h內(nèi)與UP組無顯著差異(P＞0.05)，可以得出，UP組釋氨過快，過量的氨并未被充分利用合成MCP;而CAU組MCP的含量可長時間保持較高濃度。總體上，CAU組的MCP含量也高于UP組，說明CAU組釋氨速度緩慢，可長時間為瘤胃微生物合成MCP提供氮源。

3.5 CAU對藏羊血清生化指標的的影響

血清TP和ALB在一定程度上代表了飼糧中蛋白質(zhì)的營養(yǎng)水平及動物對蛋白質(zhì)的消化吸收程度［16］。血清ALB由肝臟合成，除起到維持血漿滲透壓，提供機體蛋白質(zhì)來源和提供能量外，還是營養(yǎng)物質(zhì)的載體。本試驗中各試驗組的血清TP與ALB含量均無顯著差異(P＞0.05)，說明在飼糧中添加CAU，藏羊?qū)Φ鞍踪|(zhì)的消化吸收，以及肝臟對蛋白質(zhì)的合成未受不良影響。

尿素是哺乳動物體內(nèi)蛋白質(zhì)和氨基酸等含氮物質(zhì)代謝的終產(chǎn)物，瘤胃內(nèi)氨的濃度與BUN含量呈高度正相關(guān)，BUN濃度高低在一定程度上可以反映飼糧氮的利用效率［17］。瘤胃內(nèi)氨的濃度、瘤胃MCP的合成和體內(nèi)氨基酸的分解都會影響B(tài)UN的濃度。在飼糧中添加非蛋白含氮化合物，會提高瘤胃液的氨濃度，進而提高BUN的濃度。如果MCP的合成受阻，也會使瘤胃內(nèi)的氨濃度升高，進而造成BUN的濃度升高［18］。本試驗中，各處理間BUN濃度無顯著差異(P＞0.05)，表明各處理氮代謝均處于正常水平。

GOT和GPT是動物體內(nèi)2種與蛋白質(zhì)代謝相關(guān)的重要酶。在瘤胃微生物利用氨合成MCP的過程中，GPT催化氨基與碳架結(jié)合生成氨基酸，GOT是體內(nèi)聯(lián)合脫氨基作用的關(guān)鍵酶，使天門冬氨酸及a－酮戊二酸轉(zhuǎn)換氨基生成谷氨酸和草酰乙酸。血液中氨濃度過高時，會增加肝臟的負擔，使2種酶的活性升高。CAU組的藏羊血清GPT與GOT均略低于UP組。本試驗各處理GOT和GPT均處在藏羊正常生理范圍內(nèi)，這與前面瘤胃液NH3-N濃度處在正常范圍內(nèi)，不會引起大量NH3-N進入血液相一致。

試驗結(jié)果顯示，飼糧中添加CAU與添加SBM和 UP 比較，藏羊血清中 BUN、ALB、TP、GOT、GPT均沒有顯著差異(P＞0.05)，均在正常生理范圍內(nèi)，進一步證實飼糧中添加CAU是可行的。

4 結(jié)論

①CAU在瘤胃內(nèi)的NH3-N釋放速度減緩。

②CAU可以保證瘤胃內(nèi)環(huán)境的相對穩(wěn)定。

③CAU可長時間平緩的為瘤胃微生物提供氮源，促進瘤胃內(nèi)MCP的合成。

④飼糧中添加CAU，可以提高藏羊?qū)δ蛩氐睦盟?，且不會增加藏羊的肝臟負擔。

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