郭元晟 閆素梅，* 張和平 付果花 史彬林

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，呼和浩特 010018;2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特 010018)

許多研究結(jié)果表明發(fā)酵乳酸桿菌(L.fermentum)耐酸、生長(zhǎng)繁殖性能良好，抗逆性強(qiáng)，無(wú)毒、無(wú)殘留、無(wú)污染等，同時(shí)對(duì)小鼠、仔豬等哺乳動(dòng)物的消化功能和免疫功能有一定促進(jìn)效果，因此有望成為綠色的抗生素替代品。Huang等［1］研究報(bào)道，L.fermentum對(duì)仔豬腸黏膜具有很強(qiáng)的吸附能力，同時(shí)具有抑制大腸桿菌K88黏附的作用。在仔豬飼糧中添加L.fermentum可以顯著提高仔豬的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化率、日增重與飼料轉(zhuǎn)化率，免疫功能也明顯改善［2－3］。淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶是肉雞重要的消化酶，其活性直接影響肉雞的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化吸收進(jìn)而影響消化功能［4］。Jin等［5］報(bào)道在飼糧中添加0.1%的嗜酸乳酸桿菌，肉雞小腸內(nèi)容物淀粉酶活性顯著增高;龐暉等［6］的研究也得出了相似的結(jié)果。在肉雞飼糧中添加乳酸菌和芽孢桿菌，可刺激肉雞胰腺淀粉酶和蛋白酶的分泌，小腸淀粉酶、蛋白酶和糜蛋白酶的活性分別提高32%、15%和18%［7］。也有研究表明，即使同一菌屬的不同菌株對(duì)動(dòng)物消化酶活性的影響也不同［8］。研究也表明，在肉雞飼糧中添加保加利亞乳酸桿菌能夠提高營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化率［9］;在雞飼糧中添加0.2%含乳酸菌及雙歧桿菌等多種高活力菌的復(fù)合益生菌(活菌總數(shù)≥50 CFU/g)后，與對(duì)照組相比粗蛋白質(zhì)消化率、干物質(zhì)消化率、能量消化率分別提高了5.72%、8.76% 和 6.85%［10］。在斷奶仔豬飼糧中添加0.25%的復(fù)合乳酸桿菌(活菌數(shù)4×108CFU/m L)可以顯著提高斷奶仔豬的平均日采食量及飼糧粗脂肪的表觀消化率，極顯著提高胰臟和十二指腸食糜脂肪酶和淀粉酶活性，說(shuō)明乳酸桿菌在仔豬消化酶活性及養(yǎng)分表觀消化率等方面具有顯著的促進(jìn)作用［11］。這些研究結(jié)果提示嗜酸乳酸桿菌和芽孢桿菌對(duì)動(dòng)物的消化酶活有一定促進(jìn)效果，進(jìn)而促進(jìn)了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化，增強(qiáng)了動(dòng)物的消化功能。L.fermentum F-6是從菌種庫(kù) 90株L.fermentum中初步篩選出的一株耐酸、耐膽鹽、抗菌活性較強(qiáng)的L.fermentum，但關(guān)于L.fermentum F-6對(duì)動(dòng)物的消化功能是否有影響，研究報(bào)道極少。鑒于此，本文從肉雞消化道酶活和回腸營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化率的角度研究不同水平L.fermentum F-6對(duì)肉雞消化功能的影響，為肉雞生產(chǎn)中科學(xué)添加L.fermentum F-6提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

L.fermentum F-6是從菌種庫(kù)90株 L.fermentum中初步篩選出的一株耐酸、耐膽鹽、抗菌活性較強(qiáng)的L.fermentum，由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，有效活菌總數(shù)為2.37×1011CFU/g。肉雞苗由內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院種雞場(chǎng)提供。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)采用單因子完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，選擇1日齡體重相近、健康的愛(ài)拔益加(AA)肉仔雞240只(雌雄各占1/2)，稱重后隨機(jī)分為4個(gè)組，其中1個(gè)對(duì)照組和3個(gè)L.fermentum組(F1、F2、F3組)。對(duì)照組肉雞不飼喂L.fermentum F-6，F(xiàn)1、F2、F3組通過(guò)飲水添加L.fermentum F-6，添加水平分別為2×105、2×106和1×107CFU/m L，每組6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10只雞，各組雞的初始體重經(jīng)方差檢驗(yàn)差異均不顯著(P＞0.05)。試驗(yàn)期42 d，分2個(gè)階段飼養(yǎng)(1～21日齡、22～42日齡)。

1.3 基礎(chǔ)飼糧組成與飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)以玉米和大豆粕為主要原料，按照肉雞生長(zhǎng)發(fā)育階段，即1～21日齡和22～42日齡2個(gè)階段的不同需要來(lái)配制基礎(chǔ)飼糧，飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1，所有試驗(yàn)飼糧均以粉狀形式飼喂。雞籠內(nèi)采用紅外線加熱裝置自動(dòng)控溫，試驗(yàn)期內(nèi)采用每天23 h光照和1 h黑暗的光照及機(jī)械通風(fēng)制度，雞舍室溫在前3天內(nèi)保持33℃，以后每周降低3℃，直到舍溫達(dá)到24℃后保持恒定不變。試驗(yàn)雞自由采食、飲水。試驗(yàn)期內(nèi)每天人工清糞1次。按照常規(guī)的免疫程序進(jìn)行免疫，在整個(gè)試驗(yàn)期內(nèi)各組的試驗(yàn)條件要保持一致。

1.4 樣品的采集與制備

1.4.1 樣品的采集

在試驗(yàn)開(kāi)始后于42日齡早晨稱重后從每個(gè)重復(fù)中隨機(jī)抽取空腹雞(體重接近平均體重)2只，采用頸靜脈放血的辦法處死，立即放于冰盤(pán)上打開(kāi)腹腔，小心剝離，摘取胰腺，剝除脂肪組織和結(jié)締組織后用錫箔紙包好，立即放入液氮中快速冷凍后，轉(zhuǎn)入－20℃低溫冰箱凍存?zhèn)溆?。同時(shí)迅速地在冰浴上剪取十二指腸、空腸、回腸的中上游部位7 cm左右，小心剪開(kāi)后用預(yù)冷生理鹽水將黏膜上的食糜沖洗干凈用錫箔紙包好，放于液氮中快速冷凍后轉(zhuǎn)入－70℃低溫冰箱中凍存，用于消化酶活性的測(cè)定。收取回腸末端中的食糜于離心管中，蓋緊蓋后立即貯于－20℃下低溫保存。同時(shí)飼料樣品于自封袋中，扎緊袋口于4℃保存?zhèn)溆?。屠宰試?yàn)結(jié)束后將食糜樣品置于65℃干燥箱中烘干制備風(fēng)干樣，粉碎混勻后裝入自封袋于4℃冰箱中冷藏保存，用于消化率的測(cè)定。

1.4.2 分析樣的制備

1.4.2.1 胰腺上清液的制備

取出冷凍的胰臟，在未完全解凍前從頭、體、尾3個(gè)部位取0.5 g左右的胰臟，用解剖刀將其切成碎片，用分析天平稱重。按質(zhì)量體積比1∶4加入4℃的勻漿介質(zhì)溶液勻漿1 m in，整個(gè)過(guò)程都在冰浴中進(jìn)行。充分研磨后將勻漿液倒入離心管，于4℃、2 500×g下離心15 m in，取上清液分裝成3份貯存于－30℃冰柜中備用。

1.4.2.2 小腸黏膜上清液的制備

取出冷凍的小腸組織，放于4℃冰箱中解凍，待完全解凍后取出放于保鮮膜上，用載玻片刮取黏膜0.5 g左右，準(zhǔn)確稱重后按質(zhì)量體積比1∶4加入4℃的勻漿介質(zhì)勻漿30 s，整個(gè)過(guò)程都在冰浴中進(jìn)行。充分研磨后將勻漿液倒入離心管，于4℃、2 500×g下離心15 m in，迅速將上清液分裝成3份貯存于－30℃冰柜中備用。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of basal diets(air-dry basis) %

1.5 試驗(yàn)儀器

試管、混勻器、移液器、恒溫水浴鍋、計(jì)時(shí)器、低溫離心機(jī)(Eppendorf)、凱氏定氮儀、1281全自動(dòng)氧彈式能量測(cè)定儀、紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)、Thermo Scientific Multiskan Ascent酶標(biāo)儀。

1.6 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.6.1 消化酶活性的測(cè)定

胰腺組織與小腸黏膜中淀粉酶、脂肪酶及胰蛋白酶活性使用試劑盒測(cè)定。試劑盒由南京建成生物工程研究所提供，測(cè)定方法參照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。十二指腸糜蛋白酶活性采用酶聯(lián)免疫法(ELISA)進(jìn)行測(cè)定，試劑盒由ADL公司提供，方法參照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.6.2 回腸營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率的測(cè)定

采用內(nèi)源指示劑法測(cè)定肉雞回腸粗蛋白質(zhì)和能量的表觀消化率。其中，回腸食糜及飼料樣品中粗蛋白質(zhì)與總能的含量采用常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分分析法;內(nèi)源指示劑(4 mol的鹽酸不溶灰分)參照Vogtmann等［12］的方法進(jìn)行測(cè)定。計(jì)算公式為:飼料某養(yǎng)分消化率(%)=100－［(飼料中指示劑含量/糞中指示劑含量)×(糞中某養(yǎng)分含量/飼料中某養(yǎng)分含量)］×100。

1.7 試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理

本試驗(yàn)數(shù)據(jù)利用SAS 9.0軟件的ANOVA程序進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 L.fermentum F-6對(duì)肉雞淀粉酶活性的影響

表2結(jié)果表明，添加L.fermentum F-6可顯著提高肉雞空腸和胰腺組織淀粉酶活性(P＜0.05)，其中F2組肉雞空腸淀粉酶活性顯著高于對(duì)照組(P ＜0.05)，比對(duì)照組提高 74.34%，F(xiàn)1組和 F3組空腸淀粉酶活性與對(duì)照組相比有一定增強(qiáng)趨勢(shì)，但差異不顯著(P＞0.05);F1組和F2組胰腺組織淀粉酶活性均顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，以F2組效果較好，比對(duì)照組提高65.42%。添加L.fermentum F-6對(duì)肉雞十二指腸和回腸淀粉酶活性均無(wú)顯著影響(P＞0.05)。

表2 L.fermentum F-6對(duì)肉雞淀粉酶活性的影響Table 2 Effects of L.fermentum F-6 supplementation on the activity of am ylase in broilers U/mg prot

2.2 L.fermentum F-6對(duì)肉雞脂肪酶活性的影響

表3結(jié)果表明，添加不同水平的L.fermentum F-6對(duì)肉雞小腸黏膜及胰腺組織脂肪酶活性的影響均不顯著(P ＞0.05)。

表3 L.fermentum F-6對(duì)肉雞脂肪酶活性的影響Table 3 Effects of L.fermentum F-6 supplementation on the activity of lipase in broilers U/mg prot

2.3 L.fermentum F-6對(duì)肉雞小腸黏膜及胰腺組織胰蛋白酶活性的影響

表4結(jié)果表明，添加L.fermentum F-6可顯著提高肉雞空腸和回腸胰蛋白酶活性(P＜0.05)，尤其以F2組較好，分別比對(duì)照組提高41.61%和33.43%(P ＜0.05);添加 L.fermentum F-6對(duì)肉雞十二指腸和胰腺組織胰蛋白酶活性的影響均不顯著(P ＞0.05)。

表4 L.fermentum F-6對(duì)肉雞胰蛋白酶活性的影響Table 4 Effects of L.fermentum F-6 supplementation on the activity of trypsin in broilers U/mg prot

2.4 L.fermentum F-6對(duì)十二指腸糜蛋白酶活性的影響

表5結(jié)果表明，添加L.fermentum F-6可顯著提高肉雞十二指腸糜蛋白酶活性(P＜0.05)，其中F2組顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，比對(duì)照組提高56.08%;F1組和F3組與對(duì)照組差異不顯著，但有增強(qiáng)的趨勢(shì)(P ＞0.05)。

表5 L.fermentum F-6對(duì)肉雞十二指腸糜蛋白酶活性的影響Table 5 Effects of L.fermentum F-6 supplementation on the activity of chymotrypsin in duodenum of broilers ng/mg prot

2.5 L.fermentum F-6對(duì)肉雞回腸粗蛋白質(zhì)和能量的表觀消化率的影響

表6結(jié)果表明，添加L.fermentum F-6可顯著提高肉雞回腸粗蛋白質(zhì)和能量的表觀消化率(P＜0.05)，尤以F2組效果較好，分別比對(duì)照組提高23.56%和 18.54%(P ＜0.05)。

表6 L.fermentum F-6對(duì)肉雞營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化率的影響Table 6 Effects of L.fermentum F-6 supplementation on the nutrient digestibility in broilers %

3 討論

3.1 L.fermentum F-6對(duì)肉雞消化酶活性的影響

淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶是肉雞重要的消化酶，其活性直接影響肉雞的生產(chǎn)性能［4］。本試驗(yàn)結(jié)果表明，添加不同水平的 L.fermentum F-6對(duì)空腸和胰腺組織淀粉酶活性、空腸和回腸胰蛋白酶活性及十二指腸糜蛋白酶活性有顯著的促進(jìn)效果，尤其是以添加水平為2×106CFU/m L的F2組效果最好。結(jié)果也表明，對(duì)于添加水平為 2×105CFU/m L的 F1組、1×107CFU/m L的F3組，上述酶活性雖然與對(duì)照組相比有不同程度的增強(qiáng)，但與F2組相比呈降低趨勢(shì)。這些試驗(yàn)結(jié)果提示適量的L.fermentum F-6可以提高肉雞胰腺和小腸的淀粉酶和蛋白酶活性，提高肉雞的消化功能，而且促進(jìn)效果存在水平依賴效應(yīng)，過(guò)低或過(guò)高的添加水平均削弱了消化酶的活性，其原因尚不清楚，有待于進(jìn)一步研究。

目前，關(guān)于乳酸桿菌對(duì)消化道酶活性影響的研究主要是針對(duì)嗜酸乳酸菌和芽孢桿菌進(jìn)行的，而且研究結(jié)果不盡一致。王國(guó)霞等［13］研究表明飼喂嗜酸乳酸桿菌可以顯著提高蝦胰腺組織和腸道黏膜中蛋白酶和淀粉酶活性。Jin等［5］研究報(bào)道，給肉雞飼喂嗜酸乳酸菌可以顯著提高肉雞小腸黏膜淀粉酶活性，但對(duì)脂肪酶活性無(wú)顯著影響。Collington等［14］研究表明，飼喂乳酸菌可以顯著提高豬腸道中淀粉酶活性，但對(duì)脂肪酶活性無(wú)顯著影響，這些報(bào)道與本試驗(yàn)結(jié)果相一致。然而，王志祥等［11］報(bào)道，在飼糧中添加 0.25% 的乳酸桿菌(有效活菌數(shù)為4×108個(gè)/m L)可顯著提高斷奶仔豬胰臟和十二指腸食糜中脂肪酶的活性。邢廣林［15］研究表明，肉雞飼糧中添加0.2%的芽孢桿菌和乳酸菌復(fù)合微生態(tài)制劑能顯著提高十二指腸和胰臟內(nèi)胰蛋白酶和淀粉酶的活性，但對(duì)糜蛋白酶活性影響不顯著。張曉梅等［16］使用地衣芽孢桿菌、乳酸桿菌等混合制成的微生態(tài)制劑飼喂雛雞，能夠顯著提高雛雞腸道內(nèi)蛋白酶和脂肪酶活性。造成以上差異的因素較多，如菌株的特性、應(yīng)用水平、宿主生理狀態(tài)以及環(huán)境因素等。

關(guān)于L.fermentum F-6對(duì)肉雞消化道酶活的影響及其作用機(jī)理的研究尚未見(jiàn)資料報(bào)道。張曉梅等［16］報(bào)道，給20日齡后的雛雞飼喂不同類(lèi)型的益生素可使血清和腸道中一些消化道酶的活性顯著升高，這可能與攝入的細(xì)菌在消化道內(nèi)定植、生長(zhǎng)并繁殖，從而影響腸道微生物群落，其中的有益菌產(chǎn)生一些維生素、酶類(lèi)、短鏈脂肪酸等有益物質(zhì)促進(jìn)腸道酶的分泌有關(guān)。張春楊等［17］在肉雞飼糧中添加益生菌劑，發(fā)現(xiàn)肉雞消化道內(nèi)容物中的蛋白酶活力顯著提高，提高幅度最高可達(dá)21.76%，這可能是因?yàn)橐嫔竭_(dá)消化道內(nèi)能夠分泌并活化大量蛋白酶的緣故［18］。Jin等［19］研究發(fā)現(xiàn)，從雛雞消化道分離出的12株乳酸桿菌都能夠分泌淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶，乳酸菌在胃腸道所產(chǎn)生的有機(jī)酸有利于補(bǔ)充動(dòng)物因應(yīng)激而導(dǎo)致的胃酸分泌不足，有利于消化道內(nèi)胃蛋白酶原的激活，這2種作用都有利于消化道酶活性的提高。Yang等［20］用乳酸菌和雙歧桿菌飼喂大鼠，可以提高其消化酶活性，其機(jī)理可能是有益菌通過(guò)改善宿主胃腸道環(huán)境增加了細(xì)菌酶的分泌以及益生菌可以促進(jìn)腸道黏膜的生長(zhǎng)。

3.2 L.fermentum F-6對(duì)肉雞粗蛋白質(zhì)和能量表觀消化率的影響

有研究表明，在育肥豬飼糧中添加乳酸桿菌能夠提高蛋白質(zhì)的消化率［21］。王志祥等［11］在斷奶仔豬基礎(chǔ)飼糧中添加0.25%乳酸桿菌液體制劑(活菌數(shù)為4×108個(gè)/m L)可顯著提高飼糧粗脂肪表觀消化率，粗蛋白質(zhì)、鈣及總磷表觀消化率也有提高的趨勢(shì);楚渠等［10］的試驗(yàn)結(jié)果表明，在雞飼糧中添加0.2%的含芽孢桿菌、乳酸菌及雙歧桿菌等多種高活力菌的復(fù)合益生菌(活菌總數(shù)≥50 CFU/g)，與對(duì)照組相比粗蛋白質(zhì)消化率、干物質(zhì)消化率、能量消化率分別提高5.72%、8.76%和6.85%。本試驗(yàn)研究結(jié)果與上述研究結(jié)果相似，添加L.fermentum F-6可顯著提高肉雞回腸粗蛋白質(zhì)和能量的表觀消化率，尤以添加水平為2×106CFU/m L的F2組效果最好。結(jié)果提示適量的L.fermentum F-6可以提高肉雞回腸粗蛋白質(zhì)和能量的表觀消化率，而且提高的效果存在水平依賴效應(yīng)，過(guò)低或過(guò)高的添加水平會(huì)均削弱其對(duì)粗蛋白質(zhì)和能量表觀消化率的增強(qiáng)效果。這些研究結(jié)果與酶活性的研究結(jié)果相吻合，這進(jìn)一步說(shuō)明了L.fermentum F-6對(duì)肉雞消化功能有顯著的促進(jìn)作用，且促進(jìn)效果呈水平依賴性。由此也推測(cè)，L.fermentum F-6對(duì)肉雞營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化功能的增強(qiáng)可能是由于L.fermentum F-6可增加腸道的消化酶活性，進(jìn)而有利于飼料中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的降解，引起營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化率的提高。

4 結(jié)論

①添加L.fermentum F-6對(duì)肉雞空腸和胰腺組織淀粉酶活性、空腸和回腸胰蛋白酶活性及十二指腸糜蛋白酶活性有顯著的增強(qiáng)效果，尤以添加水平為2×106CFU/m L的F2組效果最好。

②添加L.fermentum F-6可顯著增加肉雞回腸粗蛋白質(zhì)和能量的表觀消化率，增強(qiáng)肉雞的消化功能，且增強(qiáng)效果與添加水平有關(guān)，添加水平為2×106CFU/m L時(shí)效果最明顯。

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