郭元晟 閆素梅，2* 史彬林 付果花 張和平

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，呼和浩特 010018;2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學“乳品生物技術與工程”教育部重點實驗室，呼和浩特 010018)

一些研究表明發(fā)酵乳酸桿菌(L.fermentum)對小鼠、仔豬等哺乳動物的生長性能與免疫功能有一定促進效果，但其作用機理尚不十分清楚［1－3］。小腸是動物吸收營養(yǎng)物質(zhì)的主要場所，正常的黏膜形態(tài)結構是其發(fā)揮吸收功能的基礎。由于小腸在黏膜上皮有皺襞、絨毛及微絨毛的特殊結構，進一步擴大了其吸收養(yǎng)分的表面積［4］。小腸絨毛高度、絨毛寬度和隱窩深度是反映腸道發(fā)育和營養(yǎng)物質(zhì)吸收的重要指標，因此，研究L.fermentum與小腸絨毛發(fā)育的關系是解釋其促生長機理的重要途徑。大量研究表明乳酸桿菌能夠很好地黏附于腸道上皮細胞上，防止有害菌的入侵，從而保護胃腸道黏膜，改善腸道結構［5－7］。馬治宇［5］研究表明，乳酸桿菌菌粉或菌液均可顯著提高肉雞盲腸絨毛高度，極顯著增加回腸的絨毛高度，促進肉雞腸道發(fā)育，提高營養(yǎng)物質(zhì)利用率，進而促進肉雞生產(chǎn)性能。也有研究表明，將由植物乳桿菌、乳酸片球菌和屎鏈球菌組成的益生素或酵母葡聚糖投喂初生犢牛，其十二指腸、空腸、回腸微絨毛的數(shù)目增多，結構清晰，發(fā)育整齊，因此說明乳酸桿菌具有促進小腸微絨毛的發(fā)育，維持其正常形態(tài)和結構的功能［6－7］。但目前關于L.fermentum對肉雞小腸絨毛發(fā)育影響的研究尚未見系統(tǒng)的資料報道。L.fermentum F-6是從菌種庫中90株發(fā)酵乳桿菌初步篩選出1株耐酸、耐膽鹽、抗菌活性較強的發(fā)酵乳桿菌。鑒此，本試驗主要研究L.fermentum F-6對肉雞小腸微絨毛形態(tài)的影響，從小腸微絨毛發(fā)育的角度探討其促進吸收功能的機理，為L.fermentum F-6的科學應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

L.fermentum F-6由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學乳品生物技術與工程教育部重點實驗室提供，有效活菌總數(shù)為2.37×1011CFU/g。肉雞苗由內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學院種雞場提供。

1.2 試驗動物與試驗設計

試驗采用單因子完全隨機試驗設計方法，選擇1日齡雌雄各占1/2的健康愛拔益加(AA)肉仔雞240只，稱重后隨機分為4個組，其中1個對照組和3個 L.fermentum F-6組(F1、F2、F3組)，每組6個重復，每個重復10只雞，各組雞的初始體重經(jīng)方差檢驗差異均不顯著(P＞0.05)。對照組肉雞不飼喂 L.fermentum F-6，F(xiàn)1、F2、F3 組通過飲水飼喂 L.fermentum F-6，添加水平分別為2×105、2 ×106、1 ×107CFU/m L。試驗期21 d。

1.3 試驗飼糧

試驗以玉米和豆粕為主要原料，并且按照肉雞生長需要來配制基礎飼糧，基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1，所有試驗飼糧均以粉狀形式飼喂。

1.4 飼養(yǎng)管理

試驗前對雞舍的周邊環(huán)境、雞舍以及用具進行全面消毒處理。試驗雞采用肉雞涂塑籠單層籠養(yǎng)，每一組的6個重復根據(jù)雞籠的不同位置分開排列，以便消除環(huán)境因素的影響。雞籠內(nèi)采用紅外線加熱裝置自動控溫，試驗期內(nèi)采用每天23 h光照和1 h黑暗的光照和機械通風制度，雞舍室溫在前3 d內(nèi)保持33℃，以后每周降低3℃。試驗雞自由采食、飲水。試驗期內(nèi)每天人工清糞1次。按照常規(guī)的免疫程序進行免疫，在整個試驗期內(nèi)各組的試驗條件要保持一致。

1.5 樣品采集與測定指標

1.5.1 樣品采集

試驗于21日齡時分別從每個重復中取與平均體重相近的2只雞，以頸靜脈放血法處死，立即解剖，分別截取十二指腸、回腸、空腸中段2 cm左右，用生理鹽水沖洗后迅速放入4%的甲醛固定液中搖勻，作為標本待制組織切片，每個處理12個重復。

表1 基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎)Table 1 Composition and nutrient levels of basal diet(air-dry basis) %

1.5.2 蘇木精－伊紅(HE)染色法制取組織切片

將固定好的小腸組織經(jīng)過修塊(水洗)、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、染色、透明、封固等步驟，制成常規(guī)HE染色的組織切片，厚5μm。

1.5.3 測定指標

測定十二指腸、空腸、回腸絨毛長度、寬度及隱窩深度，同時計算絨毛長度與隱窩深度的比值(V/C)。

1.5.4 肉雞腸黏膜形態(tài)觀測

將制作好的肉雞腸黏膜組織切片在Olympus SZX10顯微鏡(5×)下觀察。在各個腸道的組織切片上選取典型視野，通過Image Processing and Analysis照相處理軟件對每個組織切片選取10根小腸絨毛，并用目鏡測微尺測量每個視野中最長最寬處的絨毛長度、寬度以及隱窩的深度。

1.6 試驗數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)利用SAS 9.0軟件的ANOVA統(tǒng)計程序進行統(tǒng)計分析和二次回歸統(tǒng)計分析。其中，P＜0.05表示各組間差異或回歸關系顯著，0.05＜P＜0.10表示各組間差異或回歸關系趨于顯著。

2 結果

2.1 L.fermentum F-6對肉雞小腸絨毛長度的影響

由表2可以看出，F(xiàn)2組和F3組的十二指腸和空腸絨毛長度均顯著高于對照組(P＜0.05)，以F2組效果最好(P＜0.05);F1組雖與對照組差異不顯著，但有高于對照組的趨勢(0.05＜P＜0.10)。F1、F2、F3組回腸絨毛長度均顯著高于對照組(P＜0.05)，不同添加劑量之間也有顯著差異，F(xiàn)2組和F3組均顯著高于F1組(P＜0.05)，以F2組最大。

表2 L.fermentum F-6對肉雞小腸絨毛長度的影響Table 2 Effects of L.fermentum F-6 on length of small intestinal villus in broilers μm

2.2 L.fermentum F-6對肉雞小腸絨毛寬度的影響

由表3可以看出，F(xiàn)1、F2、F3組十二指腸絨毛寬度均顯著高于對照組(P＜0.05);其中，F(xiàn)3組的十二指腸絨毛寬度最大，顯著高于F2組(P＜0.05);F1組和F2組之間差異不顯著(P＞0.05)。F1組的空腸絨毛寬度顯著高于對照組和F2組(P＜0.05)，F(xiàn)2組和F3組的空腸絨毛寬度高于對照組，但差異不顯著(P ＞0.05)。F1、F2、F3 組回腸絨毛寬度均顯著高于對照組(P＜0.05)，但3組之間差異不顯著(P＞0.05)。

表3 L.fermentum F-6對肉雞小腸絨毛寬度的影響Table 3 Effects of L.fermentum F-6 on w idth of small intestinal villus in broilers μm

2.3 L.fermentum F-6對肉雞小腸絨毛隱窩深度的影響

由表4可以看出，F(xiàn)1、F2、F3組十二指腸隱窩深度均顯著低于對照組(P＜0.05)，且F2組顯著低于F1組和F3組(P＜0.05)。F3組的空腸絨毛的隱窩深度顯著低于對照組(P＜0.05)，F(xiàn)1組和F2組空腸絨毛隱窩深度與對照組相比差異不顯著，但有降低趨勢(P＜0.10)。F1組、F2組、F3組回腸絨毛的隱窩深度均顯著低于對照組(P＜0.05)，但 3組之間沒有顯著差異(P＞0.05)。

表4 L.fermentum F-6對肉雞小腸絨毛隱窩深度的影響Table 4 Effects of L.fermentum F-6 on depth of small intestinal crypt in broilers μm

2.4 L.fermentum F-6對肉雞小腸V/C的影響

由表5可以看出，F(xiàn)1、F2、F3組十二指腸的V/C都顯著高于對照組(P＜0.05)，且F2組顯著高于F1組和F3組(P＜0.05)，但F1組與F3組之間差異不顯著(P＞0.05)。F2組和F3組空腸的V/C都顯著高于F1組和對照組(P＜0.05)，F(xiàn)1組與對照組沒有顯著差異，但有增高趨勢(0.05＜P ＜0.10)。F1、F2、F3組回腸的 V/C 均顯著高于對照組(P＜0.05)，且F2組和F3組顯著高于F1組(P ＜0.05)，F(xiàn)2組最高。

表5 L.fermentum F-6對肉雞小腸絨毛長度與隱窩深度比值的影響Table 5 Effects of L.fermentum F-6 on V/C of small intestinal in broilers

2.5 L.fermentum F-6添加劑量與肉雞小腸絨毛形態(tài)的回歸統(tǒng)計分析結果

由表6可以看出，隨著L.fermentum F-6的添加劑量增加，L.fermentum F-6的添加劑量與十二指腸、空腸和回腸絨毛長度呈顯著的一元二次增加(P＜0.05)，根據(jù)一元二次回歸方程擬合得出，使十二指腸、空腸和回腸絨毛長度達到最大時的L.fermentum F-6 添加劑量分別為 5.6×106、5.7×106和5.8×106CFU/m L。L.fermentum F-6的添加劑量與十二指腸和空腸絨毛寬度呈顯著的一元二次增加(P＜0.05)，與回腸絨毛寬度呈趨于顯著的一元二次增加(0.05＜P＜0.10)，根據(jù)一元二次回歸方程擬合得出，使十二指腸、空腸和回腸絨毛寬度達到最大時，L.fermentum F-6的添加劑量分別為7.7 ×106、3.1 ×106和6.5 ×106CFU/m L。L.fermentum F-6的添加劑量與十二指腸和空腸隱窩深度呈顯著的一元二次降低(P＜0.05)，與回腸隱窩深度呈趨于顯著的一元二次降低(0.05＜P＜0.10)，根據(jù)一元二次回歸方程擬合得出，使十二指腸、空腸和回腸隱窩深度達到最小時，L.fermentum F-6的添加劑量分別為為5.8×106、5.7×106和5.9×106CFU/m L。L.fermentum F-6的添加劑量與V/C呈顯著增加的一元二次劑量依賴關系(P＜0.05)，與回腸絨毛寬度V/C呈趨于顯著增加的一元二次劑量依賴關系(0.05＜P＜0.10)，根據(jù)一元二次回歸方程擬合得出，使十二指腸、空腸和回腸絨毛V/C達到最大時，L.fermentum F-6的添加劑量分別為 5.1 ×106、6.1 ×106和5.8×106CFU/m L。

表6 L.fermentum F-6添加劑量與肉雞小腸絨毛形態(tài)的回歸統(tǒng)計結果Table 6 Regression results between L.fermentum F-6 dosage and small intestinal villus structure in broilers

3 討論

小腸是動物消化吸收的主要場所，腸道黏膜結構與動物消化吸收功能密切相關。小腸絨毛是小腸的主要黏膜結構，是動物腸道消化和吸收營養(yǎng)物質(zhì)的特有結構，它的長度、寬度及隱窩深度直接影響小腸的吸收面積［8－9］。絨毛長度與絨毛上皮細胞數(shù)量呈顯著正相關，只有成熟的絨毛細胞才具有吸收養(yǎng)分的功能。因此絨毛長時，成熟細胞多，養(yǎng)分吸收能力強［4］。隱窩深度反映了細胞的生成率，隱窩變淺，表明細胞成熟率上升，分泌功能強［10－11］。V/C 則是綜合反應小腸絨毛吸收功能的重要指標，當V/C增高時說明絨毛對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收能力增強，反則亦然。Pelicano等［12］研究發(fā)現(xiàn)于肉雞飼料中添加嗜酸乳桿菌和雙歧桿菌，可以顯著增加肉雞腸道絨毛長度及隱窩的深度。Gunal等［13］也發(fā)現(xiàn)肉雞飼喂1%的益生菌可顯著增加空腸與回腸的絨毛高度。Edens［14］報道，用乳桿菌飼喂動物后小腸黏膜皺裂增多，絨毛變長變寬，隱窩變淺，小腸吸收面積增大，增強了小腸對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收能力，從而提高動物日增重和飼料利用率。馬治宇［5］研究發(fā)現(xiàn)，在肉仔雞飼糧中添加1.0×1010CFU/g的乳酸桿菌菌粉或1.0×1010CFU/m L菌液，均可顯著提高回腸和盲腸的絨毛長度和腸壁厚度，其中在1和42 d時差異顯著，說明乳酸桿菌菌粉和菌液均能促進肉雞腸道發(fā)育，從而促進營養(yǎng)物質(zhì)吸收，進一步提高肉雞生長性能。

目前，關于L.fermentum F-6對肉雞小腸絨毛發(fā)育和小腸形態(tài)的研究尚未見系統(tǒng)的資料報道。本試驗研究結果表明，添加L.fermentum F-6組較對照組均能顯著提高十二指腸、空腸和回腸的絨毛長度、絨毛寬度和 V/C，降低隱窩深度，說明L.fermentum F-6對肉雞小腸的絨毛發(fā)育和小腸黏膜結構有顯著的促進和改善效果，與前人研究結果一致。產(chǎn)生這一結果的原因尚不清楚。一些研究表明乳酸桿菌能夠促進益生菌在腸道內(nèi)的增殖，有些益生菌能產(chǎn)生谷氨酰胺、精氨酸和維生素，這些物質(zhì)既是腸上皮細胞生長所需，又是腸黏膜細胞和分泌黏液的杯狀細胞等重要的組分，并且乳酸桿菌自身也能夠產(chǎn)生許多特殊的酶系和合成維生素的酶，有利于腸上皮細胞的生長［5］。Makras等［15］認為乳酸桿菌可以抑制有害菌對腸道上皮細胞的侵害，從而促進了腸道上皮細胞的生長。也有可能是乳酸桿菌改變了腸道揮發(fā)性脂肪酸的比例，而丁酸提供的能量比乙酸和丙酸對細胞分裂的促進效果明顯［16］。因此，確切的機理還有待于進一步研究。

此外，根據(jù)本試驗結果也可看出，添加L.fermentum F-6組的十二指腸、空腸和回腸的絨毛長度、絨毛寬度、降低隱窩及V/C均優(yōu)于對照組，而且多數(shù)情況下以添加劑量為2×106或1×107CFU/m L的F2組和F3組效果較好，F(xiàn)1組的絨毛寬度略好于F2組。因此，綜合多項指標初步得出L.fermentum F-6的添加劑量在2×106～1×107CFU/m L范圍內(nèi)時對小腸絨毛形態(tài)的促進和改善效果較好。同時，根據(jù)一元二次回歸曲線的擬合結果得出使小腸絨毛結構達到最佳時，L.fermentum F-6的添加劑量多數(shù)指標集中在6.0×106CFU/m L左右，在本試驗設計的F2組與F3組添加劑量之間，但由于條件所限，本次試驗尚未對該劑量的添加效果進行研究，因此還有待進一步研究。

4 結論

在本試驗條件下得出，添加L.fermentum F-6可促進小腸絨毛的生長發(fā)育，改善消化道結構，并且促進效果與添加劑量呈顯著的二次曲線依賴關系。

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